四种类型甘蓝雄性不育系花药败育特征及基因表达谱分析

论文摘要

结球甘蓝（B.oleracea var.capitata）是我国仅次于大白菜的第二大叶用蔬菜。由于结球甘蓝具有明显的杂种优势,目前全世界几乎所有主栽品种均为杂交种。利用雄性不育系生产一代杂种已经成为杂优育种的发展趋势。因而从分子和细胞学水平进一步探明不同雄性不育类型的花粉败育机理,揭示甘蓝雄性不育这一具有重大理论意义和经济价值的遗传现象的本质,有利于寻找或创造新的不育源,特别是有利于最终实现人工调控甘蓝雄性育性乃至实现对所有作物育性的人工操纵。 基于上述情况,本研究开展了以下四方面的研究工作: 1.通过树脂超薄切片光学显微镜和电子显微镜观察结合,对黑芥胞质不育（NiCMS）,隐性核不育（RGMS）,萝卜胞质不育（OguCMS）和显性核不育（DGMS）四种甘蓝雄性不育类型进行了全面系统的细胞学败育特征研究; 2.通过cDNA-AFLP技术在转录水平上对花粉发育阻断后所有非正常转录的基因与正常可育材料的基因进行比较分析,探讨雄蕊发育相关基因的发育中断网络和途径; 3.利用8张拟南芥全基因组寡核苷酸芯片（Microarray）全面分析了花药败育过程中所有基因的全局性表达,通过生物信息学手段充分挖掘和利用模式作物拟南芥在雄蕊发育相关基因方面取得的进展,为进一步阐明育性形成的不同功能途径调控网络提供重要的信息和线索; 4.对目前最有应用价值的显性雄性不育的细胞学败育机理和相关基因的功能及调控机理进行深入研究,为最终实现人工调控显性雄性不育育性提供理论依据。 获得的主要结论如下: 1.细胞学研究明确了四种雄性不育类型的主要败育时期和特征:A.黑芥胞质不育主要败育时期为造孢细胞期,主要败育特征为绒毡层细胞分化和发育异常;B.隐性核不育主要败育时期为花粉母细胞期,主要败育特征为绒毡层细胞和中层细胞异;C.萝卜胞质不育主要败育时期在四分体前期,败育特征主要表现为从减数分裂后期开始绒毡层细胞活动异常,绒毡层细胞进行性加厚;D.显性核不育主要败育时期在四分体后期,主要败育特征是小孢子不能自由释放,但花粉壁能正常沉积孢粉素,本实验另一个重要发现是,显性不育败育的直接原因并不是已经发现的包裹四分体的胼胝质壁延迟降解,而是包裹整个四分体的花粉母细胞（PMC）初生壁的持续存在。 2.利用cDNA-AFLP获得113条育性相关的TDFs,结合不同材料败育时期特征分析认为,大部分（67.25%）雄性育性相关基因的表达具有典型的顺序发育特征。提出了甘蓝花药发育相关基因的顺序表达模型,初步揭示了花药发育过程中,多数基因表现为以线性模型在不同时期顺序表达。而E、F、G、H和I等5种表达模式为不符合顺序表达模式的育性相关基因,推测可能是各种孢子体组织独立或与小孢子协调表达的旁路基因。进一步对代表不同类型的23条TDF测序表明;其中16.7%基因参与细胞壁水解酶功能。 3.芯片试验的结果表明,这四种雄性不育类型败育的根本原因都是由于绒毡层的异常干扰了小孢子的正常发育。对胞质不育类型特异下调的三种重叠关系的基因功能分析发现,NiCMS对细胞质内各种细胞器相关基因的干扰要比OguCMS要高,两种胞质不育类型线粒体功能异常对甘蓝发育的影响的分子机制近似于对生理刺激或环境胁迫的应激反应功能的下降或丧失。同时我们筛选出89个药壁组织中特异表达的基因（主要是绒毡层特异表达的基因）。进一步比较药壁

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语
• 目录
• 第一章 前言
• 1.1 甘蓝雄性不育的类型及分子生物学研究进展
• 1.1.1 甘蓝雄性不育的类型
• 1.1.1.1 甘蓝细胞核雄性不育
• 1.1.1.2 甘蓝细胞质雄性不育
• 1.1.2 甘蓝雄性不育类型小孢子发育的时空特征
• 1.1.3 甘蓝雄性不育的分子机理研究进展
• 1.1.3.1 胞质不育线粒体基因和核基因的互作表达
• 1.1.3.2 甘蓝显性核不育基因的分子生物学研究
• 1.1.4 甘蓝雄性不育的应用
• 1.1.5 甘蓝雄性不育分子机理研究的问题及展望
• 1.2 拟南芥雄蕊发育相关基因的研究进展
• 1.2.1 雄性器官建成的相关基因的功能和调控
• 1.2.2 孢原细胞分化及小孢子囊形成相关基因的功能和调控
• 1.2.3 花粉母细胞发育的调控机理
• 1.2.4 减数分裂相关基因的功能及调控机理
• 1.2.5 小孢子释放及不对称分裂相关基因的功能及调控机理
• 1.2.6 花药开裂的分子调控机理
• 1.2.7 控制花粉萌发和生活力相关基因的调控
• 1.2.8 植物雄蕊发育相关分子机理研究的意义
• 1.3 本研究的目的和意义
• 第二章 不同甘蓝雄性不育花药败育特征分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.1.2.1 光学半薄切片制备和观察
• 2.1.2.2 透射电镜样品制备和观察
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 可育花药及小孢子发育过程
• 2.2.2 黑芥胞质不育花药及小孢子发育过程
• 2.2.3 隐性核不育花药及小孢子发育过程
• 2.2.4 萝卜胞质不育花药及小孢子发育过程
• 2.2.5 显性核不育花药及小孢子发育过程
• 2.3 讨论
• 2.3.1 四种雄性不育类型花药发育的主要败育特征比较
• 2.3.2 四种雄性不育类型花药发育的主要败育时期的确定
• 2.3.3 药壁组织与小孢子的协调作用
• 2.4 小结
• 第三章 利用CDNA-AFLP检测四种甘蓝雄性不育差异基因表达模式
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 花蕾总 RNA提取
• 3.1.3 双链cDNA的合成与精制
• 3.1.4 cDNA-AFLP差异显示
• 3.1.5 差异片段回收，克隆测序及序列分析
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 差异表达的多态性分析
• 3.2.2 四种雄性不育cDNA-AFLP转录谱表达差异分析
• 3.2.3 差异表达TDFs模型分析
• 3.2.4 差异表达TDFs测序及功能分析
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 第四章 四种甘蓝雄性不育基因芯片表达谱分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 总RNA的提取和质量鉴定
• 4.1.3 基因芯片探针标记和杂交
• 4.1.4 数据的获得和处理
• 4.1.5 RT-PCR验证及分析
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 四种甘蓝雄性不育类型基因芯片数据可靠性分析
• 4.2.2 利用四种甘蓝雄性不育类型检测到的花发育相关基因
• 4.2.3 四种甘蓝雄性不育类型基因芯片差异表达分析
• 4.2.4 部分基因芯片数据的RT-PCR验证
• 4.2.5 四种甘蓝雄性不育类型检测到的育性相关基因聚类分析
• 4.2.6 四种雄性不育类型败育机理分析
• 4.2.7 雄性育性相关基因的重叠关系及功能分析
• 4.2.8 利用生物信息学手段筛选花药优势表达基因
• 4.2.9 药壁组织中特异表达的基因
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 第五章 显性雄性不育花药败育机理和相关基因功能调控分析
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 实验材料及数据处理方法
• 5.1.2 荧光显微观察方法
• 5.1.3 部分基因时空特异性表达的RT-PCR分析
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 显性雄性不育四分孢子胼胝质降解过程
• 5.2.2 显性不育基因表达谱分析
• 5.2.3 差异基因中已报道的拟南芥花药发育相关基因
• 5.2.4 显性不育差异基因中细胞壁代谢相关的基因
• 5.2.5 显性不育差异基因中信号转导相关的激酶基因
• 5.2.6 显性不育差异基因中的转录因子基因
• 5.2.7 部分差异基因的时空特异性表达
• 5.3 讨论
• 5.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历