论文题目: SARS病毒特异性抗原抗体基因和N基因的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 微生物学
作者: 刘正学
导师: 齐义鹏
关键词: 病毒,噬菌体展示单链抗体,酶联免疫吸附检测,细胞凋亡,蛋白,蛋白,辅酶细胞色素还原酶蛋白
文献来源: 武汉大学
发表年度: 2005
论文摘要: SARS于2002年11月16日首先在中国广东省佛山出现,然后迅速在全世界30多个国家或地区相继爆发流行。它是由一种从未在人类身上发现的冠状病毒(命名为“SARS病毒”)引起的、并具有高发病率和致死率的新传染性疾病。由于缺乏统一的检测、诊断标准和手段以及有效的疫苗和治疗药物,在短短10个月内,导致了8000多人染病,800多人死亡。尽管在2003年末,SARS在全世界范围内最终得到了控制,但是,在新加坡、中国台湾和大陆仍有一些零星的病例相继被报道,说明SARS有可能再次出现。因此,不管是在SARS爆发期间,或者为了应对SARS的可能再次出现,发展可靠的早期检测、诊断试剂以及有效或高效的抗SARS病毒疫苗和治疗药物一直都是各国科学家所共同关心的热点问题。 目前,SARS冠状病毒检测和诊断技术的研究和开发主要包括几个方面(Poon et al.,2003):基于病毒抗原-抗体反应的免疫测定法;针对病毒RNA的核酸检测技术、通过细胞培养和病毒分离的病毒培养法以及生物芯片技术。用免疫学方法进行感染性疾病的诊断,一般包括两个方面:1) 检测微生物的特异性抗原;2) 检测微生物的特异性抗体。不管怎样,目前正在研究和开发的ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)检测试剂盒无论是作为一种辅助鉴定SARS的临床检测手段,还是确诊手段都是非常有用的,可以认为是当前鉴定SARS感染的最有效的免疫学检测手段。因此,为了发展针对SARS-CoV的免疫学早期诊断试剂,我
论文目录:
中文摘要
英文摘要
第一章 SARS-CoV的研究进展
1.1 前言
1.2 冠状病毒的病毒粒子形态及结构
1.3 SARS病毒的分类学地位
1.4 SARS病毒的基因组结构
1.4.1 SARS病毒的ORF
1.4.2 SARS病毒的TRS
1.5 SARS病毒基因组编码蛋白的结构和功能
1.5.1 结构蛋白
1.5.1.1 S蛋白
1.5.1.2 M蛋白和E蛋白
1.5.1.3 N蛋白
1.5.2 非结构蛋白
1.5.3 附属蛋白
1.5.4 未来的发展方向
1.6 检测和诊断
1.6.1 免疫学检测技术
1.6.1.1 SARS的抗体检测
1.6.1.2 SARS的抗原检测
1.6.2 PCR检测技术
1.6.3 病毒的细胞分离培养
1.6.4 生物芯片技术
1.7 SARS的预防和治疗前景
第二章 噬菌体展示技术及应用
2.1 前言
2.2 噬菌体展示技术的基本原理及其发展
2.3 噬菌体展示文库的构建
2.3.1 噬菌体展示抗体文库的构建
2.3.2 噬菌体展示多肽文库的构建
2.4 噬菌体展示技术的应用
2.4.1 噬菌体展示库技术
2.4.2 研究珍断用试剂
2.4.3 药物设计和疫苗开发
2.4.4 抗原表位分析
2.4.5 蛋白质互作关系研究
2.4.6 蛋白酶活性中心及其底物(或抑制剂)
2.4.7 筛选亲和分离蛋白质所需的配基
本论文的研究背景、目的和意义
第三章 研究方法
3.1 分子生物学实验技术
3.1.1 质粒DNA的制备和纯化
3.1.1.1 质粒的小量制备
3.1.1.2 质粒DNA的大量制备
3.1.2 限制性酶消化
3.1.3 DNA片段回收
3.1.3.1 低熔点琼脂糖凝胶法
3.1.3.2 用试剂盒从琼脂糖凝胶中回收DNA
3.1.4 DNA片段和载体的连接
3.1.5 感受态细胞的制备
3.1.5.1 冷氯化钙法制备新鲜感受态细胞
3.1.5.2 电转化感受态细胞的制备
3.1.6 质粒DNA的转化
3.1.6.1 常规转化法
3.1.6.2 质粒的快速转化法
3.1.6.3 质粒的电转化法
3.1.7 菌种的保藏
3.2 细胞学实验技术
3.2.1 细胞培养基的配制
3.2.2 细胞传代培养
3.2.3 细胞的冻存与复苏
3.2.3.1 冻存
3.2.3.2 复苏
3.2.4 细胞转染
3.2.5 流式细胞术分析
3.3 蛋白质化学实验技术
3.3.1 用原核表达系统表达蛋白
3.3.2 Ni~(++)亲和层析法纯化蛋白质
3.3.3 Western Blot
3.3.4 噬菌体文库筛选
3.3.4.1 噬菌体十五肽文库的扩增
3.3.4.2 从培养液中提纯病毒粒子
3.3.4.3 制备饥饿态细胞
3.3.4.4 筛选过程
3.3.4.5 Input滴定
3.3.4.6 ELISA
第四章 一种新的SARS CoV特异性噬菌体展示单链抗体的鉴定
4.1 前言
4.2 材料和方法
4.2.1 文库、菌株和试剂
4.2.2 淘洗
4.2.3 scFv-噬菌体的准备
4.2.4 单克隆scFv噬菌体ELISA
4.2.5 DNA测序
4.2.6 原核表达和Western blot分析
4.2.7 SA59B scFv-抗体的产生和纯化
4.2.8 SA59B scFv-抗体的HRP标记
4.2.9 在SA59B-HRP溶液中HRP和SA59B scFv-抗体浓度的测定
4.2.10 SA59B-HRP酶结合物工作浓度的测定
4.2.11 SA59B-HRP ELISA检测SARS CoV裂解液
4.2.12 统计分析
4.3 结果与分析
4.3.1 SARS-CoV特异性结合scFvs的淘洗
4.3.2 第3轮淘洗后scFv-噬菌体文库的特异性评价
4.3.3 SA59B scFv基因的序列
4.3.4 可溶性SA59B scFv-抗体的表达
4.3.5 可溶性SA59B scFv-抗体表达的纯化
4.3.6 SA59B scFv-抗体的HRP标记
4.3.7 SA59B-HRP对SARS-CoV的结合活性评价
4.4 讨论
第五章 SARS病毒Spike蛋白羧基端321个氨基酸残基(S2-321)作为诊断抗原的研究
5.1 前言
5.2 材料和方法
5.2.1 S2-321的扩增
5.2.2 重组蛋白的原核表达
5.2.3 SDS-PAGE和Western blotting
5.2.4 酶联免疫吸附试验(ELISA)
5.3 研究结果
5.3.1 S2-321基因片段的扩增与克隆
5.3.2 S2-321在大肠杆菌BL21 DE3中表达与纯化
5.3.3 S2-321抗原和SARS恢复病人血清最低检测度的确定
5.3.4 S2-321抗原的临床诊断试验
5.4 讨论
第六章 SARS病毒N蛋白诱导细胞凋亡及其相互作用蛋白研究
6.1 前言
6.2 材料和方法
6.2.1 病毒、质粒、菌株和细胞
6.2.2 噬菌体展示文库和试剂
6.2.3 引物
6.2.4 RNA的提取
6.2.5 RT-PCR
6.2.6 N基因表达载体的构建
6.2.7 pEGFP-N转染Vero E6
6.2.8 流式细胞术检测DNA亚二倍体峰
6.2.9 N基因的原核表达与纯化
6.2.10 15肽文库的筛选
6.2.11 DNA测序
6.3 结果与分析
6.3.1 N基因的RT-PCR与克隆
6.3.2 N基因的原核表达与纯化
6.3.3 N基因诱导细胞凋亡的初步检测
6.3.4 N蛋白特异性结合15肽的淘洗
6.3.5 15肽噬菌体文库的特异性评价
6.3.6 15肽序列分析
6.3.7 N蛋白相互作用因子分析
6.4 讨论
研究总结
创新点
参考文献
博士期间发表和待发表论文
致谢
发布时间: 2006-03-27
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