高致病性PRRSV双抗夹心ELISA抗原检测试剂盒的研制及基因工程疫苗的研究

论文摘要

猪繁殖与呼吸综合征是目前危害全球养猪业最严重的病毒性传染病之一。自1987年首次在美国出现以来,一直是世界养猪业防控的难题。而在我国自2006年6月份以来高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒在湖北、湖南、江西、安徽等地的出现和流行更是给我国养猪业造成了难以估量的损失。准确、可靠的检测技术和安全、高效的疫苗是预防和控制PRRS的关键,也是目前猪病研究的热点。本文用原核表达系统对猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因进行高效可溶性表达,并制备了抗猪繁殖与呼吸综合征N蛋白单克隆抗体,以该单克隆抗体作为包被抗体建立了双抗体夹心ELISA检测方法,并进行了ELISA试剂盒的研制以期建立一套准确、可靠、方便、快捷的检测技术。另外,本研究还构建了分别以伪狂犬病毒和杆状病毒为载体的基因工程疫苗,并对疫苗的免疫效力进行了研究。1、猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达根据猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV） WUH1株的核苷酸序列设计特异性引物,经RT-PCR方法扩增获得编码核衣壳蛋白（N）的ORF7基因,将ORF7基因克隆至pGEM-T easy载体上,获得含有ORF7基因的阳性重组质粒pGEM-T-N。经测序证实无碱基误配后,再将ORF7基因亚克隆至原核表达载体pET-30a中,获得重组表达质粒pET-30a-N,转化E.coli BL21 （DE3）细胞,IPTG诱导后N蛋白得到表达,经SDS-PAGE电泳和Western Blotting检测证实N蛋白在大肠杆菌中主要以可溶性形式表达,并能与PRRSV抗体阳性猪血清反应,具有很好的免疫学活性。2、抗猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白单克隆抗体的制备以纯化后的猪繁殖与呼吸综合征病毒WUH1株ORF7基因的原核表达产物免疫Balb/c小鼠,将SP2/0骨髓瘤细胞与免疫脾细胞融合。分别使用重组N蛋白和由Marc-145细胞扩增的猪繁殖与呼吸综合征病毒作为抗原建立间接ELISA方法进行双重筛选,通过有限稀释法进行克隆。最后发现N3H12和N4D2效价显着高于其它杂交瘤细胞株,故将N3H12和N4D2用于后续研究。将N3H12和N4D2两株细胞分别接种Balb/c小鼠,制备腹水,结果腹水抗体的的效价分别为100×214和100×215。3、猪繁殖与呼吸综合征病毒双抗体夹心ELISA抗原检测方法的建立及其应用以由Marc-145细胞扩增的PRRSV WUH1株、CH-1a株和Marc-145细胞分别作为抗原,以两株纯化的单抗互为包被抗体和酶标记物进行双抗夹心ELISA检测,结果以单抗N4D2株作为包被抗体、辣根过氧化物酶标记的单抗N3H12株作为酶标记物的结果明显优于以单抗N3H12株作为包被抗体、辣根过氧化物酶标记的单抗N4D2株作为酶标记物的检测结果。通过方阵滴定确定单抗的最佳包被浓度为21μg/mL,酶标记物的最佳工作浓度为1：1000。试验的最佳反应条件为：2～8℃包被14h,37℃封闭1h,抗原与包被单抗37℃作用1h,酶标记物与抗原的最佳反应时间为37℃ 1h,底物的最佳反应时间为15min。建立了双抗体夹心ELISA诊断方法,并对其进行了敏感性、特异性、重复性试验。敏感性试验的结果为该方法对重组N蛋白的最低检测量可达6.8ng,对PRRSV的最低检测量约为150 TCID50,而RT-PCR试剂盒对PRRSV的最低检测量约为20TCID50,说明该方法具有良好的敏感性；特异性试验表明除了阳性对照外,其它几种病毒和阴性样品检测均为阴性：重复性试验表明该方法的批间重复性和批内重复性都很好；用猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗原检测试剂盒和RT-PCR检测试剂盒检测127份临床采集的血清样品,两种试剂盒的阳性符合率为84.6%,阴性符合率为86.4%,总符合率为85.8%。4、伪狂犬病毒为载体的PRRSV重组基因工程疫苗的研究在原有重组病毒rPRV-GP5m-M（共表达GP5m和M）的gG位点插入高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒WUH1株的主要免疫原性基因ORF5和猪圆环病毒2型（PCV-2）修饰型ORF2 （ORF2m）基因的表达盒即CMV-ORF5-polyA和CMV-ORF2m-polyA构建重组病毒rPRV-PRRSV-2,另外在重组病毒rPRV-GP5m-M（共表达GP5m和M）的gG位点插入CMV-SynORF5-polyA（表达优化后的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的ORF5基因）,CMV-ORF4-polyA（表达高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒WUH1株ORF4基因）和CMV-ORF5-ORF2m-polyA（融合表达高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒WUH1的ORF5基因和猪圆环病毒2型（PCV-2）修饰型ORF2（ORF2m））表达盒构建重组病毒rPRV-PRRSV-3。Western blot表明,外源目的基因均能正确的表达。小鼠动物实验证实,rPRV-PRRSV-2、 rPRV-PRRSV-3均能诱发免疫动物产生与亲本株rPRV-GP5m-M相当的特异性抗PRV抗体,并观察到诱发不同程度的特异性抗PRRSV的免疫应答,其中rPRV-PRRSV-3能够诱发更高的中和抗体水平和细胞免疫水平。5、杆状病毒表达系统介导的PRRSV基因工程疫苗研究由于杆状病毒不能在哺乳动物细胞内复制,对哺乳动物来说非常安全,所以可以用来作为将外源基因投送到体内的载体。本研究利用VSV-G修饰过的杆状病毒作为载体,消除了杆状病毒的补体敏感性。在转移载体pFast-VSV-G下游插入分别由CMV启动子驱动的编码PRRSV ORF3 （截去疏水区2-64aa）、ORF4、ORF5（修饰后）、ORF6基因,构建重组质粒pFast-CMV-ORF3456。然后将重组质粒转化DH10Bac感受态细胞获得重组穿梭载体Bacmid-CMV-ORF3456,提取Bacmid的基因组并经脂质体介导转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒BV-CMV-3456。将BV-G-3456分别以109pfu,108pfu,107pfu的剂量肌肉注射免疫小鼠,结果表明构建的重组杆状病毒BV-CMV-3456比BV-CMV-EGFP能诱导更强的免疫反应,并呈明显的剂量依赖性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表（Abbreviation）
• 第1章 文献综述
• 1.1 猪繁殖与呼吸综合征
• 1.2 PRRS的流行病学特点
• 1.3 PRRSV的病原特性
• 1.3.1 病毒的分类及特性
• 1.3.2 PRRSV的生物学特性
• 1.4 PRRSV分子生物学
• 1.4.1 基因组的基本结构
• 1.4.2 PRRSV的蛋白质
• 1.4.3 PRRSV的遗传变异
• 1.5 PRRS的诊断研究
• 1.5.1 病毒分离
• 1.5.2 分子生物学检测方法
• 1.5.3 血清学诊断方法
• 1.6 PRRSV的免疫学反应
• 1.6.1 体液免疫反应
• 1.6.2 细胞免疫反应
• 1.7 PRRS疫苗研究进展
• 1.7.1 PRRS传统常规疫苗
• 1.7.2 PRRS新型疫苗研究进展
• 第2章 高致病性PRRSV双抗夹心ELISA抗原检测试剂盒的研制
• 2.1 材料
• 2.1.1 毒株、细胞与菌株
• 2.1.2 载体和质粒
• 2.1.3 抗体、酶和相关试剂
• 2.1.4 培养基与抗生素及其配制
• 2.1.5 主要缓冲液与相关试剂及其配制
• 2.1.6 实验动物
• 2.2 方法
• 2.2.1 细胞培养和病毒增殖
• 2.2.2 病毒RNA的提取
• 2.2.3 cDNA的合成
• 2.2.4 ORF7基因的扩增
• 2.2.5 限制性内切酶酶切反应
• 2.2.6 PCR产物或酶切产物的电泳检测
• 2.2.7 PCR产物或酶切产物的回收与纯化
• 2.2.8 外源DNA片段与质粒载体的连接反应
• 2.2.9 大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法）
• 2.2.10 连接产物的转化
• 2.2.11 质粒的小量制备
• 2.2.12 诱导表达
• 2.2.13 SDS-PAGE电泳
• 2.2.14 Western blot检测分析
• 2.2.15 免疫原的制备
• 2.2.16 免疫程序
• 2.2.17 SP2/0骨髓瘤细胞的活化
• 2.2.18 SP2/0骨髓瘤细胞的制备
• 2.2.19 免疫脾细胞的制备
• 2.2.20 饲养细胞的制备
• 2.2.21 细胞融合
• 2.2.22 阳性杂交瘤细胞的筛选
• 2.2.23 杂交瘤细胞的克隆化
• 2.2.24 单克隆抗体的生产
• 2.2.25 单克隆抗体特性的鉴定
• 2.2.26 单克隆抗体的纯化
• 2.2.27 标准阴、阳性对照的制备
• 2.2.28 双抗体夹心ELISA检测方法条件的优化
• 2.2.29 单抗包被板的制备
• 2.2.30 单抗与PRRSV经典毒株和变异毒株反应性的研究
• 2.2.31 特异性检验
• 2.2.32 敏感性检验
• 2.2.33 重复性检验
• 2.2.34 符合率检验
• 2.2.35 试剂盒的稳定性检测
• 2.2.36 人工接种动物的抗原消长规律的研究
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 PRRSV ORF7基因的RT-PCR结果
• 2.3.2 原核表达质粒的构建
• 2.3.3 重组N蛋白的原核表达
• 2.3.4 Western Blotting检测
• 2.3.5 免疫原的制备
• 2.3.6 细胞融合及阳性杂交瘤细胞株的筛选
• 2.3.7 单抗腹水的制备
• 2.3.8 单抗效价的测定
• 2.3.9 单抗与PRRSV的反应性研究
• 2.3.10 单抗亚类的鉴定
• 2.3.11 单抗的纯化
• 2.3.12 包被抗体和酶标记物的选择
• 2.3.13 方阵滴定确定包被抗体和酶标记物的浓度
• 2.3.14 抗原和包被单抗最佳反应时间的确定
• 2.3.15 酶标记物与抗原最佳反应时间的确定
• 2.3.16 底物液最佳反应时间的确定
• 2.3.17 临界值的确定
• 2.3.18 ELISA操作程序的确定
• 2.3.19 经典毒株和变异毒株的检测
• 2.3.20 特异性检测
• 2.3.21 敏感性检测
• 2.3.22 重复性检测
• 2.3.23 符合率检测
• 2.3.24 稳定性检测
• 2.3.25 人工感染动物的抗原消长规律的研究
• 2.4 讨论
• 2.4.1 ORF7基因的原核表达
• 2.4.2 抗PRRSV N蛋白单克隆抗体的制备
• 2.4.3 双抗夹心ELISA抗原检测试剂盒的研制
• 2.5 小结
• 第3章 伪狂犬病毒-猪繁殖与呼吸综合征病毒（rPRV-PRRSV）重组基因工程疫苗的研究
• 3.1 材料
• 3.1.1 毒株、细胞与菌株
• 3.1.2 载体和质粒
• 3.1.3 抗体、酶和相关试剂
• 3.1.4 培养基与抗生素及其配制
• 3.1.5 免疫反应试验所用抗原及血清
• 3.1.6 主要缓冲液与相关试剂及其配制
• 3.1.7 实验动物
• 3.2 方法
• 3.2.1 细胞培养和病毒增殖
• 3.2.2 感染病毒的细胞样品总RNA的提取
• 3.2.3 总cDNA的合成及各个基因的PCR扩增
• 3.2.4 限制性内切酶酶切反应
• 3.2.5 PCR产物或酶切产物的电泳检测
• 3.2.6 线性质粒DNA末端去磷酸化
• 3.2.7 PCR产物或酶切产物的回收与纯化
• 3.2.8 外源DNA片段与质粒载体的连接反应
• 3.2.9 大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法）
• 3.2.10 连接产物的转化
• 3.2.11 质粒的制备与鉴定
• 3.2.12 重组伪狂犬病毒（PRV）基因组DNA的提取
• 3.2.13 脂质体共转染法
• 3.2.14 重组病毒的空斑纯化
• 3.2.15 PCR检测目的外源基因在重组病毒中的整合
• 3.2.16 Southern blot印迹分析
• 3.2.17 Western blot检测目的蛋白在真核细胞中的表达
• 3.2.18 GP5-ELISA试验
• 3.2.19 半数细胞培养物感染量（TCID50）的测定
• 3.2.20 微量中和试验（固定病毒-稀释血清法）
• 3.2.21 构建重组杆状病毒的操作流程及示意图
• 3.2.22 重组穿梭载体（Bacmid）的构建
• 3.2.23 重组穿梭载体（Bacmid）的提取
• 3.2.24 重组杆状病毒获得及毒价测定
• 3.2.25 重组杆状病毒转导哺乳动物细胞
• 3.2.26 小鼠脾淋巴细胞的制备
• 3.2.27 样品总RNA的提取及cDNA的合成
• 3.2.28 SYBR Green Ⅰ实时定量PCR
• 3.2.29 相对mRNA表达水平的计算
• 3.2.30 IFN-γ的定量检测（双抗体夹心ELISA）
• 3.2.31 动物实验
• 3.2.32 统计学方法
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 转移质粒pgG-CMV-EGFP的构建
• 3.3.2 转移质粒pgG-CMV-ORF2m-ORF5mut的构建
• 3.3.3 转移质粒pgG-CMV-ORF545-2m的构建
• 3.3.4 重组病毒的构建与纯化
• 3.3.5 重组病毒的Southern杂交鉴定
• 3.3.6 重组病毒的Western blot鉴定
• 3.3.7 免疫小鼠抗PRV特异性抗体的检测
• 3.3.8 免疫小鼠特异性针对PRRSV GP5的ELISA抗体
• 3.3.9 免疫小鼠特异性针对PRRSV的中和抗体
• 3.3.10 ELISA方法分析免疫小鼠脾淋巴细胞分泌的IFN-γ水平
• 3.3.11 实时荧光定量PCR检测小鼠脾细胞中IFN-γ mRNA表达
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第4章 杆状病毒表达系统介导的高致病性猪繁殖与呼吸综合征基因工程疫苗研究
• 4.1 材料
• 4.2 方法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 转移质粒pFastBac-CMV-3456的构建
• 4.3.2 重组Bacmid-CMV-3456的构建
• 4.3.3 重组杆状病毒BV-CMV-3456的获得
• 4.3.4 外源基因在哺乳动物细胞内的转录与表达
• 4.3.5 重组病毒的纯化与毒价测定
• 4.3.6 免疫小鼠的ELISA抗体水平
• 4.3.7 免疫小鼠的中和抗体水平检测
• 4.3.8 实时荧光定量PCR检测免疫小鼠脾细胞中IFN-γ mRNA表达
• 4.3.9 免疫小鼠脾细胞分泌的IFN-γ水平分析
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 参考文献
• 致谢
• 附录