纤维素高效降解菌R7的筛选、降解特性与田间应用研究

论文摘要

我国是一个农业大国,农作物收割后,田间会堆积大量的农作物秸秆,农民往往将其焚烧。而作为一种丰富的资源,秸秆焚烧不仅是一种极大的浪费,而且对环境造成了污染。本文从紫金山常绿阔叶林落叶土壤中筛选出一株纤维素高效降解菌R7,将该菌株鉴定为肉座菌属Hypocrea sp.),对其酶活特性进行了研究,并将R7与日本曲霉YN1（Aspergillus sp.）,绿色木霉ACCC30166（Trichoderma sp.）进行组合,研究了组合菌株对纤维素的降解效果。主要研究内容如下：（1）以刚果红培养基作为选择性培养基,根据水解圈的有无和大小,得到具有纤维素降解效果的真菌和细菌共8株,经过复筛,得到一株效果稳定的纤维素高效降解菌R7,经基因和形态学鉴定,将R7鉴定为肉座菌属（Hypocrea sp.）。（2）研究了碳源、氮源、培养时间、培养温度、接种时间、起始pH对R7产酶能力的影响。葡萄糖会抑制纤维素酶的产生,而CMC-Na、麸皮可以诱导其产生,表明纤维素降解菌产生的纤维素降解酶为诱导酶。最适碳源为CMC-Na,最适氮源为硝酸铵、最适培养温度为30℃、接种至三角瓶中的菌体在平板上生长4d最合适、最佳起始pH为6.0、液体培养第3d可达到最高酶活。（3）在实验室进行秸秆堆沤发酵实验,对秸秆堆的温度进行跟踪测量,发现从第4d开始,秸秆内部温度可达最高48℃,并可以维持10d左右再降低。对其碳氮比进行测定,C/N最低可到13.49,比未进行任何处理的秸秆的C/N 33.27降低了19.98,比未接菌的对照秸秆的C/N 30.16降低了16.67。可溶性物质含量,每15g可达到5.73g。综合效果为三种菌的组合与两两组合相比,三菌组合对纤维素的降解效果最好。（4）在江宁秣陵镇的一块水稻和小麦轮植的农田里进行秸秆腐熟实验,对其土壤进行跟踪采样。将所采土样用作玉米盆播实验,发现秸秆施加菌剂的田块的玉米盆播,玉米长势最好,根长最长,株高最高,只有秸秆的田块次之,空白田块最差。对所采土样进行DGGE分析,发现施用过菌剂的田块比未施用菌剂的田块微生物条带增加,说明土壤微生物区系发生改变。表明秸秆降解微生物复合菌对于改良土壤有一定的作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 文献综述
• 1 木质纤维素的结构
• 2 秸秆的营养成分
• 3 秸秆的利用价值
• 3.1 秸秆还田利用
• 3.2 秸秆的饲料价值
• 3.3 秸秆的燃料价值
• 3.4 作为工业原料使用
• 3.5 作为环保材料
• 3.6 在纳米复合材料中得到应用
• 4 纤维素酶的组成
• 5 纤维素酶作用机理假说
• 5.1 Cl-Cx假说
• 5.2 协同理论
• 5.3 原初反应假说
• 5.4 短纤维素形成理论
• 6 纤维素菌筛选的方法
• 6.1 好氧菌的筛选方法
• 6.1.1 以羧甲基纤维素钠做碳源的选择性培养基
• 6.1.2 以滤纸做碳源的选择性培养基
• 6.2 厌氧菌的筛选方法
• 6.3 复合菌系的筛选方法
• 7 纤维素酶活的测定
• 7.1 葡萄糖标准曲线的制备
• 7.2 纤维素全酶活性的测定
• 7.3 内切β-1,4葡聚糖酶活的测定
• 7.4 外切β-1,4葡聚糖水解酶活的测定
• 7.5 β-葡萄糖苷酶活的测定
• 8 纤维素降解菌复合体系
• 9 秸秆降解微生物在秸秆腐熟中的应用
• 10 秸秆腐熟过程中影响微生物活动的条件
• 10.1 水分
• 10.2 通气量
• 10.3 有机质含量
• 10.4 C/N比
• 10.5 pH值
• 10.6 温度
• 11 纤维生物降解试验评价方法
• 12 秸秆利用存在的一些问题
• 13 主要研究内容
• 研究内容
• 第一章 纤维素高效降解菌的分离与鉴定
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 2.1 纤维素高效降解菌的初筛
• 2.2 纤维素高效降解菌的复筛
• 2.3 纤维素高效降解菌株的鉴定
• 3 实验结果
• 3.1 纤维素高效降解菌的初筛
• 3.2 纤维素高效降解菌的复筛
• 3.3 纤维素高效降解菌的鉴定
• 4 本章小结
• 第二章 纤维素高效降解菌R7的产酶特性研究
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 2.1 R7液体发酵酶活的测定
• 2.1.1 葡萄糖标准曲线的制作
• 2.1.2 粗酶液的制备
• 2.1.3 全酶活（FPA）的测定
• 2.1.4 内切酶酶活测定
• 2.1.5 外切酶酶活的测定
• 2.1.6 β-葡萄糖苷酶酶活的测定
• 2.2 R7在滤纸及秸秆表面定殖观察
• 2.3 R7液体发酵条件优化
• 2.3.1 碳源对R7产酶的影响
• 2.3.2 不同氮源对R7产酶的影响
• 2.3.3 不同pH值对R7产酶的影响
• 2.3.4 不同培养温度对R7产酶的影响
• 2.3.5 培养时间对R7产酶的影响
• 2.3.6 接种菌龄对R7产酶的影响
• 2.4 R7的产酶曲线
• 3 实验结果
• 3.1 R7酶活的测定
• 3.2 R7在滤纸及秸秆表面定殖观察
• 3.3 碳源对R7菌株产酶的影响
• 3.4 氮源对R7菌株产酶的影响
• 3.5 pH值对R7产酶的影响
• 3.6 温度对R7产酶的影响
• 3.7 培养时间对R7产酶的影响
• 3.8 接种菌龄对R7产酶的影响
• 3.9 R7菌株的产酶曲线
• 4 本章小结
• 第三章 纤维素降解菌组合菌株的固体发酵及其产酶特性
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 2.1 纤维素高效降解菌组合菌的筛选
• 2.2 纤维素降解菌组合菌的固体发酵条件优化
• 2.2.1 培养温度对固体发酵产酶的影响
• 2.2.2 氮源对产纤维素酶的影响
• 2.2.3 培养时间对产酶的影响
• 2.2.4 培养基含水量对产酶的影响
• 3 实验结果
• 3.1 组合菌株的液体发酵
• 3.2 组合菌的固体发酵
• 3.3 影响固体发酵的条件
• 3.3.1 温度对固体发酵的影响
• 3.3.2 氮源对组合菌株产酶的影响
• 3.3.3 培养时间对组合菌株产酶的影响
• 3.3.4 含水量对组合菌株产酶的影响
• 4 本章小结
• 第四章 纤维素降解菌组合菌株的应用
• 1 实验材料
• 1.1 菌株
• 1.2 菌株培养
• 2 实验方法
• 2.1 混合菌株对秸秆降解效果的实验室效果检测
• 2.2 秸秆降解混合菌株的田间应用
• 3 实验结果
• 3.1 纤维素降解组合菌株的实验室效果评价
• 3.1.1 腐熟过程中秸秆的外观变化
• 3.1.2 腐熟过程中温度的变化
• 3.1.3 腐熟后的秸秆碳氮比情况
• 3.1.4 水溶性物质的变化
• 3.2 秸秆腐熟菌剂的田间应用
• 3.2.1 实验室盆钵实验
• 3.2.2 土壤微生物区系的改变
• 全文总结
• 附录
• 参考文献
• 论文创新点
• 致谢