中华根瘤菌VB12发酵工艺及其phbC基因研究

论文摘要

中华根瘤菌（Sinorhizobium）是一类好氧异养型革兰氏阴性细菌,能够与豆科植物共生固氮,是土壤中常见的一类菌群。目前,’国内外对中华根瘤菌的研究主要集中在与植物共生的关系、制作根瘤菌剂、提高固氮效率和环境修复方面,也有报道发现某些菌株能够产生VB12。本实验室分离获得一株能够产生VB12的菌株,通过16SrDNA测序鉴定,该菌株属中华根瘤菌属（S.sp.）,是一个全新的菌株,命名为kd23。培养过程中发现,该菌除了产生VB12之外,细胞还有大量聚羟基丁酸（PHB）积累。PHB颗粒在发酵前期大量积累,后期部分分解,与VB12的合成似乎存在一定联系。因此,研究二者的内在联系,有重要的理论价值。我们推测,阻断PHB的合成,细胞积累3-羟基丁酰辅酶A,可能有效提高VB12的合成产量。利用常规发酵条件调查和工艺优化方法初步研究了菌株kd23的生长和VB12发酵过程。确定其发酵最适碳源为麦芽糖；氮源为玉米浆和甜菜碱；糖浓度维持在20g/L有利于提高VB12的产量；钴离子在发酵过程中有决定性的作用。优化后的发酵周期,192 h,VB12的产量达到120 mg/L。利用分子生物学方法和基因操作技术克隆了PHB合成过程中关键酶——PHB合成酶基因phbC。通过常规PCR和不均一PCR,得到了1859 bp的phbC基因片段,与苜蓿中华根瘤菌（S. meliloti Rm41）一致性84%。应用分子生物学技术构建了含有phbC基因同源臂和氯霉素抗性基因的整合载体pPHBCAT质粒,为失活中华根瘤菌phbC基因提供了材料。关于该菌株的分子生物学研究尚未见报道,为研究PHB颗粒与VB12之间的关系,我们建立了S. sp. kd23遗传转化系统。通过抗生素敏感性验证实验,确定10μg/L氯霉素可以用于S. sp. kd23的筛选。应用含phbC上下游同源臂和氯霉素抗性基因的PCR产物进行电击转化,结果表明,在25μF,200 Ω,2.2 kV,2 mm电转杯的条件下,得到了13个克隆子。PCR鉴定结果表明,我们获得了phbC基因沉默的转化子。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 中华根瘤菌简介
• 1.1.1 根瘤菌特征
• 1.1.2 中华根瘤菌
• 12的途径'>1.2 中华根瘤菌产生维生素B₁₂的途径
• 12简介'>1.2.1 维生素B₁₂简介
• 12途径'>1.2.2 中华根瘤菌产VB₁₂途径
• 1.3 中华根瘤菌产生聚羟基丁酸（PHB）颗粒的途径
• 1.3.1 PHB颗粒简介
• 1.3.2 中华根瘤菌产生PHB的途径
• 1.4 PHB颗粒对中华根瘤菌代谢和产VB12的影响
• 1.5 根瘤菌产PHB相关基因研究
• 1.6 课题研究内容意义
• 12中华根瘤菌的鉴定'>第2章 产VB₁₂中华根瘤菌的鉴定
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料与仪器
• 2.2.2 细菌培养基及培养
• 2.2.3 细菌形态及PHB颗粒观察
• 2.2.4 基因组提取及电泳检测
• 2.2.5 PCR克隆
• 2.2.6 DNA纯化
• 2.2.7 DNA测序
• 2.2.8 生长曲线测定方法
• 12检测'>2.2.9 VB₁₂检测
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 细菌形态及PHB颗粒观察
• 2.3.2 生长曲线
• 2.3.3 基因组提取结果
• 2.3.4 16S rDNA PCR结果
• 2.3.5 16SrDNA测序比对结果
• 12测定结果'>2.3.6 VB₁₂测定结果
• 2.4 本章小结
• 12初步发酵研究'>第3章 中华根瘤菌产VB₁₂初步发酵研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 材料与仪器
• 3.2.2 培养基配制和菌培养
• 3.2.3 生物量测定方法
• 3.2.4 残糖测定方法
• 12测定方法'>3.2.5 维生素B₁₂测定方法
• 3.2.6 中华根瘤菌常见碳源调查
• 12发酵监测'>3.2.7 中华根瘤菌维生素B₁₂发酵监测
• 3.2.8 甜菜碱用量调查
• 3.2.9 金属离子调查
• 3.2.10 发酵过程补糖研究
• 3.3 结果分析
• 3.3.1 麦芽糖检测标准曲线绘制
• 12检测体系'>3.3.2 VB₁₂检测体系
• 3.3.3 中华根瘤菌常见碳源调查
• 3.3.4 中华根瘤菌发酵参数监测
• 3.3.5 甜菜碱用量对发酵的影响
• 3.3.6 离子对发酵的影响
• 3.3.7 中华根瘤菌发酵补糖研究
• 3.4 本章小结
• 第4章 phbC基因及其上下游序列克隆
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料和仪器
• 4.2.2 细菌的培养
• 4.2.3 中华根瘤菌基因组DNA提取
• 4.2.4 phbC基因内部序列克隆
• 4.2.5 不均一PCR方法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 phbC内部序列克隆
• 4.3.2 phbC 5'端序列克隆
• 4.3.3 phbC 5'端序列克隆结果验证
• 4.3.4 phbC 3’端序列克隆
• 4.3.5 3'端扩增目的条带结果及鉴定
• 4.3.6 phbC基因及其上下游序列
• 4.4 本章小结
• 第5章 pPHBCAT整合载体构建
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 材料和试剂
• 5.2.2 细菌的培养
• 5.2.3 根瘤菌基因组DNA提取
• 5.2.4 氯霉素抗性质粒构建
• 5.2.5 氯霉素抗性质粒转入大肠杆菌
• 5.2.6 含phbC基因质粒的构建及鉴定
• 5.2.7 质粒提取方法
• 5.2.8 pPHBCAT载体构建
• 5.2.9 pPHBCAT质粒转入大肠杆菌及鉴定
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 氯霉素抗性质粒构建及鉴定
• 5.3.2 含phbC基因质粒的构建及鉴定
• 5.3.3 pPHBCAT质粒构建及鉴定
• 5.4 本章小结
• 第6章 中华根瘤菌遗传转化系统建立
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 材料与仪器
• 6.2.2 中华根瘤菌的培养
• 6.2.3 中华根瘤菌抗生素敏感性验证
• 6.2.4 转化DNA片段准备
• 6.2.5 中华根瘤菌感受态制备
• 6.2.6 中华根瘤菌电转化
• 6.2.7 转化子筛选和鉴定
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 中华根瘤菌抗生素敏感性验证
• 6.3.2 电击转化结果
• 6.3.3 phbC基因敲除转化子鉴定
• 6.4 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间所发表的论文
• 致谢