论文摘要
菜籽粕是菜籽榨油后的副产物。菜籽多糖的研究与开发有利于菜籽粕的综合利用。对于菜籽多糖的结构国外已有一些研究,而对于其功能活性则未见有文献报道。本文以华杂4号“双低”菜籽粕为原料,利用傅里叶变换红外光谱学（FT-IR）、气相色谱（GC）、高效液相色谱（HPLC）、气相色谱质谱联用（GC-MS）、核磁共振（NMR）对分离纯化得到的菜籽多糖进行组成和结构表征,并采用化学发光分析评价其体外清除自由基能力,MTT法、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）等细胞生物学和分子生物学方法研究了菜籽多糖对脾淋巴细胞、腹腔巨噬细胞的免疫调节作用。主要研究结果如下:1菜籽多糖的制备及表征。菜籽多糖的制备及表征国外已有较多研究。本文重点研究了华杂4号菜籽粕中多糖的提取优化条件、绿色环保的纯化工艺以及表征方法。1.1经过前处理的脱脂菜籽粕,按照中心组合实验（CCD）得到的水溶性多糖提取优化工艺条件,即以水按液料比为28:1（mL/g）在94℃浸提2.9 h,一次提取菜籽多糖得率为2.18%,连续提取三次将水溶性多糖提取殆尽。剩余的残渣料再以5%NaOH溶液作提取剂,按料液比1:20,60℃提取2 h,得到的提取液以4 M HCl溶液中和至pH=5。得到的水溶性多糖和碱溶性多糖两部分提取液分别经筛选出的特1号大孔吸附树脂柱层析、分步醇沉、DE-52纤维素离子交换柱层析等方法纯化,分别得到各自的主要级分WPS-1和APS-2。WPS-1和APS-2再通过葡聚糖凝胶G-200柱层析和凝胶渗透色谱（GPC）进行纯度鉴定,结果表明WPS-1和APS-2都是相对均一多糖。1.2 WPS-1和APS-2均为白色絮状的非淀粉多糖;中性糖含量分别为83.2%和66.8%;糖醛酸含量分别为6.1%和9.3%;蛋白质含量分别为3.78%和8.65%。WPS-1和APS-2中蛋白质部分都由天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等9种氨基酸组成。GPC法测定WPS-1和APS-2的重均分子量（Mw）分别为7.20×105和1.61×105,数均分子量（Mn）分别为2.45×105和6.79×105。FT-IR、GC、HPLC初步分析WPS-1和APS-2的官能团特征及单糖组成,确定WPS-1单糖主要由阿拉伯糖（Ara）、半乳糖（Gal）、葡萄糖（Glc）、葡萄糖醛酸（GlcA）组成,其摩尔百分含量分别为66.6%、18.3%、12.6%、2.51%;APS-2单糖组成包括Ara、Gal、Glc、甘露糖（Man）、半乳糖醛酸（GalA）、GlcA、Rha摩尔百分含量分别为52.8%、21.7%、10.6%、5.0%、4.8%、3.6%、1.4%。通过甲基化分析以及一维NMR(包括13C NMR和1H NMR)对WPS-1的结构表征进行了研究,结合前人的相关研究成果,得出WPS-1的主体部分是主要是由（1→5）键和（1→2）键连接的Ara残基组成的多支链α-阿拉伯聚糖。2菜籽多糖的体外活性。菜籽多糖的生物活性本实验室曾作初步研究,国内外未见有菜籽多糖生物活性的报道。本文重点从细胞、分子水平上研究了菜籽多糖的生理活性。2.1分别采用邻苯三酚-鲁米诺、硫酸铜-邻菲哕啉-抗坏血酸-双氧水、鲁米诺-双氧水三种化学发光体系,通过微弱发光测量仪测定了WPS-1和APS-2对超氧阴离子(O2·-)、羟基自由基（HO·）和双氧水（H2O2）三种ROS的体外清除作用。结果表明WPS-1和APS-2对各ROS都有良好的体外清除作用,且都呈剂量-效果关系。WPS-1和APS-2在实验最高浓度2000μg/mL时,对O2·-的极大抑制率分别为90.4%和89.6%。WPS-1和APS-2对O2·-的半数抑制浓度(IC50)分别为400±44μg/mL和450±64μg/mL。WPS-1比APS-2具有更好的清除O2·-能力。WPS-1和APS-2在实验最高浓度1000μg/mL时,其对HO·的极大抑制率分别为93.8%和86.7%。WPS-1和APS-2对HO·的IC50分别为240±18μg/mL和293±24μg/mL。WPS-1比APS-2具有更好的清除HO·的能力。WPS-1和APS-2在实验最高浓度50μg/mL时,其对H2O2的极大抑制率分别为84.2%和85.2%。WPS-1和APS-2对H2O2的IC50分别为10.0±0.8μg/mL和6.1±0.5μg/mL。APS-2清除H2O2的能力略强于WPS-1。比较IC50值,WPS-1和APS-2对各自由基的清除能力都表现为:H2O2＞HO·＞O2·-。2.2采用尼龙毛柱法从脾淋巴细胞分离T、B淋巴细胞。通过MTT法检测,菜籽多糖对总脾淋巴细胞和T淋巴细胞具有明显的增殖活性,并表现出明显的剂量-效果关系,增殖的最佳浓度为40μg/mL,并且WPS-1比APS-2作用效果更好。采用半定量RT-PCR进一步研究菜籽多糖WPS-1对T淋巴细胞分泌的细胞因子白细胞介素2（IL-2）、IL-4、IL-6、干扰素γ（IFN-γ）mRNA表达的影响。首先研究了各细胞因子mRNA随WPS-1作用时间的变化,WPS-1促进IL-2、IL-4、IL-6 mRNA表达最佳作用时间都为24 h,而促进IFN-γmRNA表达的最佳作用时间为12 h。采用各细胞因子mRNA表达的最佳作用时间,进一步考察WPS-1浓度的影响,得到其对促进IL-2、IL-6、IFN-γmRNA表达的最佳浓度都为40μg/mL,而对IL-4则为20μg/mL。菜籽多糖可能对淋巴细胞的免疫功能具有调节作用。2.3采用MTT法检测细胞的活性,菜籽多糖能促进巨噬细胞增殖,并表现出明显的剂量-效果关系,菜籽多糖促进巨噬细胞增殖的最佳浓度为40μg/mL,WPS-1比APS-2对巨噬细胞增殖活性的促进作用略大。菜籽多糖对巨噬细胞的影响与对T淋巴细胞的检测结果相类似,。采用半定量RT-PCR进一步研究不同作用时间下40μg/mL菜籽多糖WPS-1对腹腔巨噬细胞IL-6、肿瘤坏死因子α（TNF-α）这两种细胞因子以及诱生型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA表达的影响。WPS-1对腹腔巨噬细胞IL-6、TNF-α和iNOS mRNA的表达量最大的时间为24 h。菜籽多糖可能对巨噬细胞的免疫功能具有调节作用。
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缩略语表摘要Abstract第一章 文献综述1.1 引言1.2 菜籽粕各成分研究利用进展1.2.1 蛋白质1.2.2 酚类化合物1.2.3 植酸1.2.4 芥酸1.2.5 硫甙1.2.6 糖类1.3 文献研究菜籽多糖的方法与达到的水平1.3.1 菜籽多糖的提取、分离与纯化1.3.1.1 预处理1.3.1.2 菜籽多糖的提取1.3.1.3 菜籽多糖的纯化1.3.2 菜籽多糖的组成及结构分析1.3.3 菜籽多糖的功能活性研究1.4 展望参考文献第二章 菜籽粕多糖提取工艺研究2.1 引言2.2 材料与方法2.2.1 实验材料2.2.1.1 菜籽粕原料2.2.1.2 主要试剂2.2.1.3 主要仪器2.2.2 实验方法2.2.2.1 提取多糖所用菜籽粕原料的筛选2.2.2.2 菜籽多糖提取及纯化工艺路线2.2.2.3 多糖含量的测定方法2.2.2.4 多糖得率计算2.2.2.5 菜籽粕中水溶性多糖提取的单因素实验2.2.2.6 菜籽粕中水溶性多糖提取的中心组合实验2.2.2.7 数据处理2.3 结果与分析2.3.1 提取多糖所用菜籽粕原料的确定2.3.2 提取单因素对水溶性多糖得率的影响2.3.2.1 提取时间对多糖得率的影响2.3.2.2 水料比对多糖得率的影响2.3.2.3 提取温度对多糖得率的影响2.3.2.4 提取次数对多糖得率的影响2.3.3 中心组合实验2.3.3.1 中心组合实验方案与结果2.3.3.2 响应面分析2.3.3.3 岭嵴分析2.4 讨论参考文献第三章 菜籽多糖的分离纯化工艺研究3.1 引言3.2 材料与方法3.2.1 实验材料3.2.1.1 菜籽多糖提取液3.2.1.2 主要试剂3.2.1.3 主要仪器3.2.2 实验方法3.2.2.1 酚类的测定3.2.2.2 蛋白质的测定3.2.2.3 中性糖的测定3.2.2.4 糖醛酸的测定3.2.2.5 大孔吸附树脂的筛选3.2.2.5.1 大孔吸附树脂的预处理3.2.2.5.2 供试样3.2.2.5.3 静态吸附实验3.2.2.5.4 动态吸附实验3.2.2.6 大孔吸附树脂柱层析初步纯化菜籽多糖3.2.2.7 DE-52纤维素离子交换柱层析分级纯化3.2.2.8 菜籽多糖的纯度鉴定3.2.2.9 糖含量及相关成分分析3.3 结果与分析3.3.1 大孔吸附树脂的筛选结果3.3.1.1 树脂对菜籽酚类化合物和蛋白质的静态吸附性能3.3.1.2 树脂对菜籽中酚类化合物、蛋白质的动态吸附性能3.3.1.3 菜籽酚类化合物、蛋白的泄漏点和饱和点3.3.2 WPS和APS的DE-52纤维素柱层析3.3.3 菜籽多糖分级组分的纯度鉴定3.3.3.1 WPS-1和APS-2的Sephadex G-200柱层析3.3.3.2 WPS-1和APS-2的GPC分析3.3.4 菜籽多糖纯化组分的理化分析3.3.4.1 主要理化性质3.3.4.2 中性糖、糖醛酸含量及蛋白质含量3.3.4.3 氨基酸组成分析3.4 讨论3.4.1 菜籽多糖的纯化工艺3.4.2 WPS-1和APS-2的理化性质参考文献第四章 菜籽多糖的结构研究4.1 引言4.2 材料与方法4.2.1 材料4.2.1.1 菜籽4.2.1.2 主要试剂4.2.1.3 主要仪器与设备4.2.2 实验方法4.2.2.1 紫外光谱分析4.2.2.2 红外光谱分析4.2.2.3 单糖组成分析4.2.2.4 甲基化分析1H NMR和13C NMR分析'>4.2.2.5 核磁共振1H NMR和13C NMR分析4.3 结果与分析4.3.1 菜籽多糖WPS-1和APS-2的紫外光谱分析4.3.2 红外光谱分析4.3.3 气相色谱分析4.3.4 液相色谱分析4.3.5 甲基化分析4.3.6 核磁共振分析13C NMR图谱'>4.3.6.1 WPS-1的13C NMR图谱1H NMR图谱'>4.3.6.2 WPS-1的1H NMR图谱4.4 讨论4.4.1 WPS-1和APS-2的结构比较4.4.2 通过甲基化反应对WPS-1结构的解析4.4.3 通过NMR对WPS-1结构的解析参考文献第五章 菜籽多糖体外清除自由基活性研究5.1 引言5.2 材料与方法5.2.1 材料5.2.1.1 菜籽多糖5.2.1.2 主要试剂5.2.1.3 主要仪器与设备5.2.2 实验方法2·-的清除作用'>5.2.2.1 对O2·-的清除作用·的清除作用'>5.2.2.2 对HO·的清除作用2O2的清除作用'>5.2.2.3 对H2O2的清除作用5.2.2.4 数据处理5.3 结果与分析2·-的清除作用'>5.3.1 对O2·-的清除作用·的清除作用'>5.3.2 对HO·的清除作用2O2的清除作用'>5.3.3 对H2O2的清除作用5.4 讨论5.4.1 化学发光法测定ROS的特点5.4.2 多糖的抗氧化机理参考文献第六章 菜籽多糖对小鼠脾淋巴细胞的免疫作用6.1 引言6.2 材料与方法6.2.1 材料6.2.1.1 菜籽多糖6.2.1.2 动物材料6.2.1.3 主要试剂6.2.1.4 主要仪器6.2.2 实验方法6.2.2.1 脾淋巴细胞的分离6.2.2.2 T、B淋巴细胞的分离6.2.2.3 细胞成活率的检测6.2.2.4 菜籽多糖不同培养时间对小鼠淋巴细胞相关细胞因子mRNA表达的影响6.2.2.5 不同浓度菜籽多糖对小鼠淋巴细胞相关细胞因子mRNA表达水平的影响6.2.2.6 数据处理6.3 结果与分析6.3.1 菜籽多糖对小鼠脾淋巴细胞活性的影响6.3.2 不同培养时间下菜籽多糖对脾T淋巴细胞相关细胞因子mRNA表达水平的影响6.4 讨论6.4.1 菜籽多糖对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响6.4.2 菜籽多糖对小鼠脾T淋巴细胞相关细胞因子的mRNA表达水平的影响参考文献第七章 菜籽多糖对小鼠腹腔巨噬细胞的免疫作用7.1 引言7.2 材料与方法7.2.1 材料7.2.1.1 菜籽多糖7.2.1.2 动物材料7.2.1.3 主要试剂7.2.1.4 主要仪器7.2.2 实验方法7.2.2.1 腹腔巨噬细胞的分离7.2.2.2 巨噬细胞的纯化7.2.2.3 巨噬细胞的接种和培养7.2.2.4 细胞成活率的检测7.2.2.5 WPS-1对小鼠腹腔巨噬细胞中细胞因子mRNA表达水平的影响7.2.2.6 菜籽多糖对小鼠腹腔巨噬细胞iNOS的mRNA表达水平的影响检测7.2.2.7 数据处理7.3 结果与分析7.3.1 WPS-1对小鼠腹腔巨噬细胞成活率的影响7.3.2 菜籽多糖对小鼠腹腔巨噬细胞各细胞因子mRNA表达水平的影响7.3.3 菜籽多糖对小鼠腹腔巨噬细胞iNOS的mRNA表达水平的影响7.4 讨论7.4.1 菜籽多糖促进小鼠腹腔巨噬细胞增殖7.4.2 菜籽多糖促进小鼠腹腔巨噬细胞中细胞因子TNF-α、IL-6以及iNOS的mRNA表达7.4.3 多糖增强巨噬细胞活性的机理参考文献第八章 结论附录一 图表目录（按先后顺序排列）附录二 研究生期间发表的论文致谢
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