L-谷氨酰胺高产菌株的选育和发酵条件优化

论文摘要

本论文首先确定了发酵液中L-谷氨酰胺的定性定量测定方法,然后应用代谢控制发酵原理,系统地研究了L-谷氨酰胺产生菌的选育,并确定了摇瓶发酵条件,主要研究内容和结果如下:（1）纸层析-分光光度计法测定发酵液中L-谷氨酰胺的含量。首先确立了展开剂为正丙醇:氨水（V/V）=5:2时,L-谷氨酰胺与L-谷氨酸之间的分离效果最好,二者之间无重叠现象。采用721分光光度计测定吸光度,最佳吸收波长选择在510 nm处有最大吸光度,对测定的准确性有利;洗脱时间为30 min时效果最佳;进一步对样品进行重复性试验、加标回收率试验,经反复试验,最终结果表明该方法重复性良好,回收率高,说明用此法测定L-谷氨酰胺含量具有较高的可靠性,为后续研究工作奠定了坚实的基础。（2）以嗜乙酰乙酸棒杆菌（Corynebacterium acetoacidophilum）YG13（MSOR）为出发菌株,采用UV、DES和NTG诱变处理,采用磺胺胍、硫酸铵两种药物平板,及分别以琥珀酸、L-谷氨酸为唯一碳源平板的定向筛选,最后获得一株L-谷氨酰胺产生菌YL012（MSOR,SGR,（NH4）2SO4R,SucG,L-GluG）。在未经优化的条件下发酵液中可积累L-谷氨酰胺34.3 g/L,比出发菌株产量提高了15.4 g/L。（3）通过对种子培养基的优化,及培养条件的研究,最后得出种子培养基的最佳组成为（g/L）:葡萄糖25,硫酸铵5,KH2PO4 1,MgSO4·7H2O 0.5,玉米浆40,CaCO3 20;培养条件为:种子培养基初始pH为7.0,装液量定为250 mL三角瓶装40 mL种子培养基,30℃,100 r/min,培养9 h。通过对发酵培养基的优化,及培养条件的研究,最后得出摇瓶发酵培养基的最佳组成为（g/L）:葡萄糖123.4,硫酸铵47.8,KH2PO4 1.0,MgSO4·7H2O 0.6,MnSO4·4H2O 0.005,FeSO4·7H2O 0.01,ZnSO4·7H2O 0.005,玉米浆4.3,CaCO3 30;最佳培养条件:发酵液培养基初始pH为7.5,接种量为8 %,装液量为250 mL三角瓶装15mL发酵培养基,30℃,100 r/min,培养72 h。产酸稳定在40.6 g/L,比未经优化提高了18 %。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 L-谷氨酰胺的理化性质
• 1.3 L-谷氨酰胺的生理特性
• 1.4 L-谷氨酰胺的营养和应用
• 1.4.1 L-谷氨酰胺的营养
• 1.4.2 L-谷氨酰胺的应用
• 1.5 L-谷氨酰胺的国内外市场及生产情况
• 1.6 L-谷氨酰胺的生产方法
• 1.6.1 化学酰化法
• 1.6.2 酶法生产L-谷氨酰胺
• 1.6.3 直接发酵法生产L-谷氨酰胺
• 1.7 发酵法生产L-谷氨酰胺的国内外研究现状
• 1.8 研究意义
• 1.9 本论文的研究内容
• 第二章 发酵液中L-谷氨酰胺含量测定方法的确定
• 2.1 引言
• 2.2 材料
• 2.2.1 主要试剂
• 2.2.2 主要仪器设备
• 2.2.3 主要试剂配制
• 2.3 方法
• 2.3.1 定性定量测定L-谷氨酰胺的主要步骤
• 2.3.2 标准偏差
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 层析展开剂的选择
• 2.4.2 洗脱液最佳吸收波长的测定
• 2.4.3 最佳洗脱时间的测定
• 2.4.4 L-谷氨酰胺标准曲线的测定
• 2.4.5 方法重复性试验
• 2.4.6 回收试验
• 2.5 本章小结
• 第三章 L-谷氨酰胺产生菌的选育
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 出发菌株
• 3.2.2 主要试剂和仪器
• 3.2.3 培养基
• 3.2.4 培养方法
• 3.2.5 诱变方法
• 3.2.6 筛选方法
• 3.2.7 分析方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 活菌数量与OD 值之间的关系
• 3.3.2 生长曲线的测定及诱变用细胞培养时间的确定
• 3.3.3 诱变剂量和时间的确定
• 3.3.4 L-谷氨酰胺菌种选育结果
• 3.3.5 菌株YL012 的遗传稳定性试验
• 3.4 本章小结
• 第四章 L-谷氨酰胺摇瓶发酵条件的研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 菌种及培养方法
• 4.2.2 主要试剂与仪器
• 4.2.3 培养方法
• 4.2.4 分析方法
• 4.3 结果和讨论
• 4.3.1 种子培养基及其培养条件的优化
• 4.3.2 发酵培养基及其培养条件的优化
• 4.4 本章小结
• 第五章 结论与展望
• 5.1 主要结论
• 5.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文