硅烷化氨基磁性微球的制备及其固定化酶应用研究

论文摘要

纳米磁性微球（Nano-Magnetic Particles,NMPs）是20世纪70年代后逐步产生、发展、壮大的一种应用前景广阔的新型磁性材料,由于其具有良好的磁响应性、粒径小、比表面积大、生物相容性好等优点而广泛地应用于生物技术各个领域,如细胞分离、靶向给药、免疫检测、蛋白质和核酸的分离纯化以及固定化酶等。本文对氨基磁性微球的制备、表征及固定化酶及其应用进行了研究。1.以改进的化学共沉淀法制备Fe3O4纳米微球。透射电子显微镜鉴定其粒径大小为6nm-12nm,粒径分布均匀且分散性较好;其饱和磁化强度为62.6emu/g,剩磁和矫顽力接近于0,具有超顺磁性;X射线衍射结果显示自制的Fe3O4属于立方尖晶石型结构;578cm-1和3421cm-1处强烈红外吸收光谱也和标准Fe3O4的特征吸收峰吻合。2.采用溶胶凝胶工艺,在醇水溶液中以氨水为碱催化剂,以自制的Fe3O4纳米微球为核,以正硅酸乙酯（TEOS）为前驱体,制备出包被Fe3O4/SiO2复合纳米磁球。复合纳米磁球直径大小为20nm-30nm左右,分散效果比较理想;饱和磁化强度为55.2emu/g,具有超顺磁性;X射线衍射图谱与标准Fe3O4图谱相一致,没有明显SiO2衍射峰的存在,说明包覆SiO2以无定型的形态存在。1097 cm-1和950 cm-1处红外吸收峰和标准SiO2图谱相吻合,说明SiO2成功与Fe3O4复合。3.以包被Fe3O4/SiO2复合纳米磁球为核,使用硅烷化试剂（APTES）制备了氨基磁性微球。其粒径大小约为40nm,饱和磁化强度50emu/g,具有超顺磁性;粒子表面富含氨基。4.将硅烷化氨基磁性微球用于固定化葡聚糖内切酶,探讨了葡聚糖内切酶的最佳固定化条件,以羧甲基纤维素钠为底物,研究了固定化酶的酶学性质和动力学参数。结果表明:当戊二醛浓度在3%,固定化时间为6小时,给酶量为600uL时,固定化酶的酶活最高;固定化酶的最适反应温度为60℃,最适反应pH值为7.0,Km值为24.39mg/mL,酶活回收率为26.3%。重复使用5次后,固定化酶的酶活保持了原来的56.1%。5.另外将硅烷化氨基磁性微球用于固定化木瓜蛋白酶,同样探讨了木瓜蛋白酶的最佳固定化条件,并以酪蛋白为底物,研究了固定化酶的酶学性质和动力学参数。结果表明:当戊二醛浓度在5%,固定化时间为4小时,给酶量为10mg/g时,固定化酶的酶活最高;固定化酶的最适反应温度为70℃,最适反应pH值为6.8,Km值为34.48mg/mL,酶活回收率为46.5%。重复使用10次后,固定化酶的酶活保持了原来的60.4%。固定化酶在热稳定性、pH稳定性和操作稳定性上较游离酶得到了一定的提高。6.将固定化木瓜蛋白酶用于水解绿豆分离蛋白以获得富含营养价值的绿豆多肽,对绿豆分离蛋白的水解度进行了检测。结果表明绿豆蛋白的水解度为8.5%,绿豆分离蛋白经固定化木瓜蛋白酶水解后,其性质得到了一定改善,更易于被肠道吸收。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 复合纳米磁性微球的特点
• 1.1 纳米磁性微球（NANO-MAGNETIC PARTICLES,NMPs）的结构特点和制备
• 1.1.1 纳米磁性材料的独特效应
• 1.1.2 纳米磁性微球的制备
• 1.2 复合纳米磁性微球的性质和制备
• 1.2.1 复合纳米磁性微球的性质
• 1.2.2 复合纳米磁性微球的制备
• 2 硅烷化氨基磁性微球应用于固定化酶
• 2.1 固定化酶的研究
• 2.1.1 固定化酶简介
• 2.1.2 固定化酶的制备方法
• 2.2 硅烷化氨基磁性微球固定化酶的应用
• 2的磁性微球硅烷化后固定化酶'>2.2.1 未包覆SiO₂的磁性微球硅烷化后固定化酶
• 2的磁性微球硅烷化后固定化酶'>2.2.2 包覆SiO₂的磁性微球硅烷化后固定化酶
• 3 研究目的和意义
• 第二章 硅烷化氨基磁性微球的制备及表征
• 1 材料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 主要实验设备
• 2 方法
• 3O₄纳米粒子的制备'>2.1 FE₃O₄纳米粒子的制备
• 3O₄表面包覆SIO₂'>2.2 FE₃O₄表面包覆SIO₂
• 3O₄/SIO₂复合纳米磁球的氨基化'>2.3 FE₃O₄/SIO₂复合纳米磁球的氨基化
• 2.4 磁性微球的表征
• 3 结果与讨论
• 3.1 透射电子显微镜（TEM）检测结果及分析
• 3.2 振动样品磁强计（VSM）检测结果及分析
• 3.3 外光谱（FTIR）检测结果及分析
• 4 本章小结
• 第三章 硅烷化磁性微球固定化B-内切葡聚糖酶的研究
• 1 实验试剂及仪器
• 2 实验方法
• 2.1 固定化内切葡聚糖酶的制备
• 2.2 酶活力的测定
• 2.2.1 酶活力测定方法
• 2.2.2 酶活力的计算
• 2.3 固定化酶条件的研究
• 2.3.1 戊二醛浓度的影响
• 2.3.2 给酶量的影响
• 2.3.3 固定化时间的影响
• 2.4 溶液酶和固定化酶性质的研究
• 2.4.1 溶液酶和固定化酶的米氏常数
• 2.4.2 溶液酶和固定化酶的最适反应pH和pH稳定性
• 2.4.3 溶液酶和固定化酶的最适反应温度和温度稳定性
• 2.4.4 固定化酶的储存和操作稳定性
• 3 结果与分析
• 3.1 固定化条件的研究
• 3.1.1 戊二醛浓度的影响
• 3.1.2 给酶量的影响
• 3.1.3 固定化时间的影响
• 3.2 溶液酶和固定化酶性质的研究
• 3.2.1 溶液酶和固定化酶的米氏常数
• 3.2.2 溶液酶和固定化酶的最适反应pH和pH稳定性
• 3.2.3 溶液酶和固定化酶的最适反应温度和温度稳定性
• 3.2.4 溶液酶和固定化酶的储存和操作稳定性
• 4 本章小结
• 第四章 硅烷化磁性微球固定化木瓜蛋白酶的研究
• 1 实验试剂及仪器
• 2 实验方法
• 2.1 木瓜蛋白酶的固定化
• 2.2 木瓜蛋白酶活力的检测方法
• 2.3 酶固定化最佳条件摸索
• 2.3.1 戊二醛浓度的影响
• 2.3.2 固定化时间的影响
• 2.3.3 给酶量的影响
• 2.4 溶液酶和固定化酶最佳反应条件摸索
• 2.4.1 溶液酶和固定化酶的米氏常数
• 2.4.2 溶液酶和固定化酶的最适pH和pH稳定性
• 2.4.3 溶液酶和固定化酶的最适反应温度及热稳定性
• 2.4.4 溶液酶和固定化酶的储存和操作稳定性
• 3 结果与分析
• 3.1 酶固定化最佳条件摸索
• 3.1.1 戊二醛浓度的影响
• 3.1.2 固定化时间的影响
• 3.1.3 给酶量的影响
• 3.2 溶液酶和固定化酶最佳反应条件摸索
• 3.2.1 溶液酶和固定化酶的米氏常数
• 3.2.2 溶液酶和固定化酶的最适pH和pH稳定性
• 3.2.3 溶液酶和固定化酶的最适反应温度和热稳定性
• 3.2.4 溶液酶和固定化酶的储存和操作稳定性
• 4 本章小结
• 第五章 固定化木瓜蛋白酶的应用研究
• 1 材料与仪器
• 2 实验方法
• 2.1 绿豆分离蛋白粉的制备方法
• 2.2 蛋白质含量测定
• 2.3 木瓜蛋白酶活力测定
• 2.4 酶解反应
• 2.5 水解度测定
• 3 结果
• 4 本章小结
• 第六章 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录