论文摘要
耐辐射球菌（Deinococcus radiodurans）是地球上最耐辐射的生物之一,同时它对其他DNA损伤,例如,紫外线、过氧化氢,干燥等也具有很强的抵抗性。细菌的辐射抵抗性主要是由于它的超强的双链DNA断裂（double-stranded DNAbreaks,DSBs）修复能力。6500 KGy照射后细菌的基因组可以产生几百个DSBs,但耐辐射球菌可以在几个小时内重建完整的基因组。现在的研究证实基因组的重建过程分为两个不同的阶段:首先是一个不依赖于RecA的修复过程,随后是依赖于RecA的重组修复。不依赖于RecA的修复阶段可能是通过SSA或者ESDSA来完成的。国内外科学家用芯片技术筛选了一些辐射处理后大量表达基因,对其中部分基因遗传学分析发现细菌中至少存在ddrA和ddrB两条不依赖于RecA的修复途径。ddrA已经发现主要参与保护辐射后细菌基因组的降解。但是ddrB的具体功能还不清楚。基因组测序和比较基因组学研究发现,耐辐射球菌基因组缺乏RecBCD和RecET等参与重组修复途径的关键基因,但是有完整的RecFOR修复途径的基因,例如recf、recO、recR、recJ、recA、recQ、ruvA、ruv9、recN、ruvC等。虽然有限实验也推测RecFOR修复途径在DNA损伤修复中有重要作用,但该途径在耐辐射球菌细胞内中的具体作用还不清楚。本研究主要对ddrB和RecFOR修复途径关键基因recO的功能做了分析,并对这两个基因在细菌DNA损伤修复中关系做了探讨。具体内容如下:1.运用PCR突变三段连接法克隆具有自身groEL启动子与卡那霉素抗性基因融合的DNA片段反向重组到基因组中,构建并鉴定了卡那霉素抗性完全突变株ddrB::groEL-kan,γ辐射条件下和H2O2氧化压力下突变株生存率结果表明:突变株对γ辐照变得敏感,但H2O2处理突变株和野生型R1区别不大。推测ddrB可能对辐照造成的DNA损伤修复具有重要的作用。2.在recA突变的基础上构建了recA/ddrB双突变,并用脉冲场电泳比较了recA突变株和recA/ddrB双突变株辐照处理后的修复动力学。结果显示,和recA单突变比较,recA/ddrB双突变修复的第一个阶段被抑制。进一步了证实ddrB基因主要在第一个阶段发挥作用。3.在大肠杆菌中大量表达DdrB蛋白,将DdrB蛋白纯化后,对其体外功能进行了分析。DdrB蛋白在体外非特异性的与DNA结合,但对单链DNA结合具有偏好性。同时DdrB蛋白可以保护双链DNA免受核酸酶的攻击。该蛋白可以促进单链DNA的退火。单链结合蛋白SSB可以促进DdrB介导的单链DNA的退火。试验表明DdrB和SSB可以在体外相互作用,并且两个蛋白可以协同的和单链DNA结合。我们推测ddrB基因在体内主要是以SSA的方式参与不依赖RecA的修复途径的。4.为研究RecFOR修复途径在耐辐射球菌辐射抗性中的作用,我们突变了该修复途径中关键基因recO。recO基因突变后细菌在正常生长条件下的生长变得非常缓慢,与recA突变株的情况相似,表明recO基因是细菌生长的重要基因。γ辐射条件下和UV照射压力下的生存率表明,recO突变后的生存曲线和recA突变几乎一样,显示该基因是耐辐射球菌DNA损伤修复的关键基因,并且细菌DNA损伤主要RecFOR修复途径来修复的。5.在recO突变的基础上构建了recO/ddrB双突变,用脉冲场电泳比较了recO和recO/ddrB双突变株γ辐照处理后的修复动力学。结果显示recO突变株和recA突变株的修复动力学相似,而recO/ddrB双突变和recA/ddrB双突变相似,表明recO主要参与第二阶段的修复,而ddrB主要参与第一阶段的修复。