苹果钙依赖蛋白激酶MdCPK1：分子克隆、表达、定位及被脱落酸的激活

论文题目: 苹果钙依赖蛋白激酶MdCPK1：分子克隆、表达、定位及被脱落酸的激活

论文类型: 博士论文

论文专业: 果树学

作者: 邹克琴

导师: 张大鹏

关键词: 苹果,钙依赖蛋白激酶,克隆,表达,脱落酸

文献来源: 中国农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 在果实发育过程中,脱落酸是一种重要的调节因子。从脱落酸的产生到激发生理反应要经过一系列相互紧密联系的级联环节。蛋白激酶所催化的蛋白质磷酸化过程在细胞生命活动的许多过程都起着重要的调节作用,在细胞信号转导中处于核心地位。因此,揭示脱落酸信号转导过程中相关蛋白激酶的生理功能具有重要科学意义。本实验室前期研究发现苹果果实中存在受脱落酸激活的钙依赖蛋白激酶,为研究钙依赖蛋白激酶在苹果果实发育中的功能,以新红星/海棠（Malus Domestica Bork cv. Starkrimson/Malus micromalus）果实中的RNA为模板,根据钙依赖蛋白激酶基因的保守序列,设计合成简并引物,通过RT-PCR方法克隆了715bp的中间保守序列,经过DNA序列测定和NCBI Blast分析,其与钙依赖蛋白激酶基因有很高的同源性。利用RACE的方法得到157bp的3’末端基因和208bp的5’末端基因,并且再次利用RT-PCR克隆了全长cDNA（GenBank登录号AY395701）,命名为MdCPK1。其全长1993bp,编码区长1632bp。经过软件分析,MdCPK1基因编码544个氨基酸,分子量是60kD,其氨基酸序列和烟草,番茄,胡萝卜,拟南芥分别有75.0996,74.55%,72.83%,71.12%的同源性,核苷酸序列分别有66.48%,71.57%,71.00%,68.00%的相似性。MdCPK1编码的蛋白具有N端可变区,激酶区,连接区和四个保守的钙结合区（即EF-hand）,具有典型的CDPK特征。利用生物信息学软件分析,MdCPK1在198—200位氨基酸和290—293位氨基酸具有两个跨膜区。以包含5’非翻译区和N端可变区的500bp片断为探针,用α-32PdCTP做探针,Southern Blot结果表明,MdCPK1相关基因在苹果基因组中可能有两个拷贝。为了进一步研究MdCPK1的功能,通过RT-PCR方法,从果实总RNA中扩增1632bp的MdCPK1的完整的基因编码区和MdCPK1的N端可变区162bp片断。利用DNA重组技术,将其连接到原核表达载体pGEX-4T-1,构建了全长基因原核表达载体pGEX-MdCPKL和N端片断原核表达载体pGEX-MdCPKN。将原核表达载体转化大肠杆菌DH5 α菌株,经过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,SDS-PAGE电泳发现,两个载体都分别正确表达出了86kD的GST-MdCPKL融合蛋白和32kD的GST-MdCPKN融合蛋白。可溶性分析表明,表达的GST-MdCPKN融合蛋白是可溶的,表达产物直接分泌到上清液中,表达量高达1.0g/L,但表达的GST-MdCPKL融合蛋白以包涵体的形式存在于沉淀中。通过亲和层析,SDS-PAGE得到较纯的GST-MdCPKN融合蛋白和GST-MdCPKL融合蛋白。将纯化的融合蛋白免疫小鼠,根据酶联免疫（ELISA）分析,Protein dot blot和Western blotting分析,结果表明,所制得的这两种抗体有良好的特异性和较高的检测灵敏度。为进一步研究MdCPK1的蛋白定位,利用DNA重组技术,将MdCPK1全长基因其连接到植物瞬时表达载体pEZS-NL上,构建了全长基因瞬时表达载体pMdCPKL-GFP。将表达载体分别用PEG融合法和基因枪轰击法转化拟南芥原生质细胞和洋葱表皮细胞,以增强型绿色荧光蛋白EGFP为报告基因,通过激光共聚焦扫描显微镜（Confocal）观察,结果表明,MdCPK1蛋白主要定位在细胞的膜体系上。分别提取苹果果实的微粒体蛋白和胞质可溶性蛋白,Western blot结果也表明,MdCPK1蛋白仅存在于果实微粒体膜蛋白组分中。

论文目录:

缩略语表

中文摘要

英文摘要

第一章文献综述

1.脱落酸信号转导研究进展

1.1 脱落酸的结合位点与受体

1.2 脱落酸与胞内信使

1.3 ABA的调控机制

1.4 脱落酸在果实发育中的生理作用

1.5 研究展望

2.植物蛋白激酶研究进展

2.1 植物蛋白激酶

2.2 植物蛋白激酶家族分类

2.3 植物体中蛋白质磷酸化及其调节机制

2.4 植物蛋白激酶的生理功能

2.5 研究展望

3.钙依赖蛋白激酶(CDPK)研究进展

3.1 CDPK序列结构和生化特性

3.2 CDPK活性的调控

3.3 CDPK底物以及专一性

3.4 研究展望

4.绿色荧光蛋白(GFP)的应用

5.本研究的目的和意义

6.本研究主要内容

第二章苹果类钙依赖蛋白激酶全长基因的克隆及其序列分析

摘要

1 材料与方法

1.1.材料

1.2 MdCPK1全长基因的克隆策略

1.3 引物的设计

1.4 苹果果实RNA的提取

1.5 总RNA及浓度的测定

1.6 cDNA第一链的合成

1.7 cDNA第二链的合成

1.8 MdCPK1保守序列的扩增

1.9 PCR产物的纯化与回收

1.10 目的片断和测序载体的连接

1.11 重组质粒的转化

1.12 重组质粒的鉴定

1.13 MdCPK1 5’端基因的克隆(5’—RACE)

1.14 MdCPK1 3’端基因的克隆(3’—RACE)

1.15 MdCPK1全长基因的扩增

1.16 苹果基因组DNA的提取

1.17 Southern blot

2.结果与分析

2.1 .RNA的质量检查结果

2.2 MdCPK1保守同源片段的获得

2.3 MdCPK1 5’端基因的克隆(5’—RACE)

2.4 MdCPK1 3’端基因的克隆(3’—RACE)

2.5 MdCPK1全长基因的克隆

2.6 MdCPK1的序列同源性分析

2.7MdCPK1蛋白的跨膜区分析

2.8 MdCPK1的系统进化树分析

2.9 MdCPK1的Southern Blot分析

3.小结

4.讨论

英文摘要

第三章苹果类钙依赖蛋白激酶的原核表达及抗体制备

摘要

1.材料与方法

1.1 材料

1.2 原核表达载体pGEX—MdCPK~L的构建

1.3 原核表达载体pGEX-MdCPK~N的构建

1.4 GST-MdCPK~L融合蛋白和GST-MdCPK~N融合蛋白的原核诱导表达

1.5 GST-MdCPK~L融合蛋白和GST-MdCPK~N融合蛋白的检测

1.6 细菌的裂解和包涵体的制备

1.7 融合蛋白的亲和纯化

1.8 抗原的制备

1.9.免疫小鼠

1.10 抗血清效价的测定(ELISA)

1.11 抗体的纯化

1.12 Protein dot blot分析

1.13 SDS-PAGE和Western Blot

2.结果与分析

2.1.原核表达载体pGEX-MdCPK~L的构建

2.2 GST-MdCPK~L融合蛋白的诱导表达

2.3.GST-MdCPK~L蛋白免疫小鼠的血清效价(ELISA)的测定结果

2.4.GST-MdCPK~L蛋白Protein Dot Blot

2.5.原核表达载体pGEX-MdCPK~N的构建

2.6.GST-MdCPK~N融合蛋白的诱导表达

2.7.GST-MdCPK~N蛋白免疫小鼠的血清效价(ELISA)的测定结果

2.8.GST-MdCPK~N蛋白的Protein Dot Blot

3.小结

4.讨论

英文摘要

第四章苹果类钙依赖蛋白激酶的亚细胞定位

摘要

1.材料与方法

1.1.材料

1.2 瞬时表达载体pMdCPK~L-GFP的构建

1.3.苹果果肉微粒体的制备

1.4.蛋白质含量的测定

1.5.SDS-PAGE和Western blot

1.6 拟南芥原生质体的分离

1.7 荧光素醋酸盐(FDA)染色

1.8 PEG融合法转化原生质体

1.9 基因枪法转化基因到洋葱表皮细胞

1.10 显微镜观察

2 结果与分析

2.1.瞬时表达载体pMdCPK—GFP的构建

2.2.拟南芥原生质体的分离

2.3.荧光素醋酸盐(FDA)染色结果

2.4.pMdCPK~L-GFP在洋葱表皮细胞的亚细胞定位结果

2.5.pMdCPK~L-GFP在拟南芥原生质体细胞的亚细胞定位结果

2.6 MdCPK1蛋白在苹果果实不同组分的表达

3 小结

4 讨论

英文摘要

第五章苹果类钙依赖蛋白激酶在果实中特异表达并受到脱落酸的激活

摘要

1.材料与方法

1.1.材料

1.2.ABA处理实验

1.3.苹果叶片RNA的提取

1.4 DNA的去除

1.5 RNA浓度的测定

1.6 RT-PCR反转录

1.7 苹果elongation factor genes(EF-1a)的扩增

1.8 苹果MdCPK1目的基因(510bp)的扩增

1.9 苹果果肉微粒体的制备

1.10.蛋白质含量的测定

1.11.SDS-PAGE和Western blot

2.结果与分析

2.1.MdCPK1的组织特异性研究

2.2.外源ABA处理对MdCPK1蛋白表达量的影响

3.小结

4.讨论

英文摘要

第六章结论与推论

参考文献

致谢

个人简历

发布时间: 2005-07-22

苹果钙依赖蛋白激酶MdCPK1：分子克隆、表达、定位及被脱落酸的激活

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