红树林土壤Streptomyces violaceoruber clade的选择性分离

论文摘要

用五点采样法从福建九龙江口、广东湛江特呈岛及深圳福田、广西北海以及海南的三亚、儋州、清澜港、东寨港等8个地点的红树林采集了8份红树林土壤样品，利用链霉菌的系统发育特异引物对这8个地点的土壤样品提取的土壤总DNA进行了PCR扩增。对结果阳性的8个土样及它们的混合样，通过湿热、DDC(分散梯度离心)、风干等预处理方法将其在DH、RH、YE、Gause培养基上进行链霉菌及Streptomyces violaceoruber clade的分离。共分离到216株放线菌，对纯培养物进行发酵，发酵液作抗B16肿瘤细胞活性及抗MRSA活性测定，得到抗B16肿瘤细胞活性菌株46株，占总菌株数的21.30％，福建红树林分离到的微生物菌株数不仅多，而且活性菌株比率也较高。得到抗MRSA活性菌株25株，占总菌株数的9.72％，广东深圳红树林分离的MRSA菌活性菌株最多共6株，而且活性菌株比率也最高为27.27％。根据YE培养基上的培养特征对分离到的放线菌初步归类分群，结合测活结果选取28株菌作为代表菌株进行16S rDNA序列分析和细胞壁氨基酸糖份分析(薄板层析TLC)，将分离到的放线菌鉴定到属，并构建系统发育树。28株放线菌分布在3个属，分别是：链霉菌属、野野村菌属、马杜拉放线菌属。分析不同预处理方法及分离培养基对分离结果的影响发现：DDC技术处理土样，分离到的菌株主要来自A部分；水浴加热预处理红树林样品时，条件为55℃，20min处理风干红树林土样分离效果好；RH培养基分离的菌株数最多，长出的放线菌多样并少有黄白色链霉菌长出；DH培养基适合于Streptomyces violaceoruber clade的选择性分离。Streptomyces violaceoruber clade宜在酸性环境下分离得到，在pH偏碱的环境中而难于分离到。用核糖核苷类合成酶基因、氨基糖苷类合成酶基因、聚酮合酶基因中的保守序列的特异引物分别对各个代表菌株进行PCR扩增，PCR扩增结果与测活结果比较显示：对某些酶扩增结果阳性的菌株，在抗肿瘤细胞或者抗MRSA未检测到活性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 目的
• 1.2 红树林环境
• 1.3 生物勘探
• 1.4 链霉菌及其Streptomyces violaoeoruber clade
• 1.4.1 链霉菌及其次级代谢途径研究
• 1.4.2 Streptomyces violaceoruber clade
• 1.5 链霉菌的选择性分离
• 1.5.1 从环境样品中抽提繁殖体
• 1.5.2 环境样品的预处理
• 1.5.3 选择性培养基和非选择性培养基
• 1.6 链霉菌的分类学
• 1.6.1 化学分类
• 1.6.2 基因型分类
• 1.7 展望
• 2 材料与方法（Materials and Methods）
• 2.1 Streptomyces violaceoruber clade分离
• 2.1.1 培养基
• 2.1.2 样品
• 2.1.3 链霉菌的生物勘探
• 2.1.4 Streptomyces violaceoruber clade的选择性分离
• 2.2 活性检测
• 2.2.1 抗肿瘤活性检测
• 2.2.2 抗MRSA活性检测
• 2.2.3 活性强度标准
• 2.3 代表菌株的16S rDNA序列分析
• 2.3.1 放线菌基因组DNA的提取
• 2.3.2 琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度及浓度
• 2.3.3 16S rDNA的PCR扩增
• 2.3.4 16S rDNA测序
• 2.3.5 序列的校对、整理及分析
• 2.4 放线菌细胞壁化学分析（薄板层析TLC）
• 2.4.1 代表菌株的细胞壁氨基酸分析
• 2.4.2 代表菌株的细胞壁糖份分析
• 2.5 代表菌株的生物活性相关酶基因扩增
• 3 结果与分析（Results and Analysis）
• 3.1 红树林土壤中的Streptomyces violaceoruber clade分离
• 3.1.1 红树林土壤理化性质及养分含量
• 3.1.2 链霉菌的生物勘探
• 3.1.3 链霉菌的分离结果
• 3.1.4 链霉菌的形态分群
• 3.2 活性检测
• 3.2.1 抗肿瘤细胞活性
• 3.2.2 抗MRSA活性检测
• 3.3 代表菌株的选择及初步分类鉴定
• 3.3.1 代表菌株的选择
• 3.3.2 代表菌株的16S rDNA序列分析
• 3.3.3 代表菌株的细胞壁化学分析
• 3.4 代表菌株的多种酶基因扩增
• 4 讨论
• 4.1 不同地区红树林样品对分离结果的影响
• 4.2 土样预处理方法对分离结果的影响
• 4.3 培养基对分离结果的影响
• 4.4 不同地区红树林分离到放线菌活性比较
• 4.5 Streptomyces violaceoruber clade分离情况
• 4.6 细胞壁分析结果与16S rDNA系统发育分析结果比较
• 4.7 多种酶基因特异片段扩增结果与微生物活性测定结果比较
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢