论文摘要
研究背景及意义:支气管哮喘（简称哮喘）是严重影响人类健康的慢性呼吸道疾病之一,以气道非特异性炎症、气道反应性增高及气道重建为主要特征。但哮喘发病的慢性,易变性,发作性特征显示疾病发生机制复杂性和难治性。哮喘的发生与发展受多种基因的调控,从而决定哮喘各种临床表型。近来证据支持基因与环境因素的协调作用在哮喘发生发展发挥着至关重要的作用。氧化应激与哮喘发生发展密切相关,涉及哮喘自然病史、气道炎症、气道高反应性、气道血管通透性增加、组织损伤及气道重建等。尽管如此,有关氧化应激在哮喘的作用及机制的研究进展缓慢。以N-乙酰半胱氨酸（NAC）为代表的抗氧化治疗,广泛应用于肺部疾病治疗,但其临床实践仍较为有限。这可能与氧化应激分子如活性氧（ROS）具有易变性特点、能够活化多种细胞内信号转导通路及当前对ROS引起的确切生理及病理学作用效果尚不清楚有关。因此深入开展哮喘氧化应激机制研究,寻找疾病特异的氧化应激因素,可能为哮喘防治提供新的理论依据和作用靶点。气道上皮细胞（AEC）具有复杂的屏障功能,作为防御吸入有害物质及病原微生物的第一道防线。近十年来,“AEC缺陷学说”逐渐成为解释哮喘发病机制的主流观点。AEC与多种环境因素（包括内环境）相互作用,通过AEC及上皮-间充质营养单元（EMTU）在启动和维持气道炎症及气道重建上发挥主要调节作用。目前认为,AEC的结构完整性缺陷或功能紊乱是哮喘的启动环节。哮喘病人AEC经常处于外源性和内源性氧化应激环境下,当AEC出现抗氧化功能缺陷或过度氧化应激时,这种平衡被打破,引起固有免疫系统及获得性免疫系统活化。研究已经证实哮喘患者AEC更易受到氧化应激而发生损伤,也更易于凋亡,增加AEC通透性。这充分提示AEC氧化抗氧化失平衡在哮喘发病中的重要作用。本研究关注主要靶点:维生素D3上调蛋白1（VDUP1）是2005年本实验室初次筛选并证实与哮喘嗜酸粒细胞（EOS）存活、炎症介质释放及肺功能改变明显相关的基因。既往研究支持:VDUP1作为早期反应基因,具有多种生物学功能,参与了氧化应激,应力信号转导,细胞生长与分化,脂质代谢及粘膜免疫等过程,证实与糖尿病,肿瘤,心血管等复杂疾病密切相关。VDUP1是主要氧化还原调控蛋白硫氧还蛋白（TRX）的关键抑制因子,而TRX和谷胱苷肽（GSH）系统是并行重要的抗氧化调控系统。因此本研究即是在前期研究基础上,进一步探讨VDUP1在哮喘氧化应激的可能作用及参与AEC氧化应激调控的分子机制,为未来针对哮喘氧化应激治疗及干预提供新的理论依据。方法:1.建立小鼠哮喘模型,探讨VDUP1在哮喘肺组织的表达及分布情况,分析抗氧化剂NAC对VDUP1的干预作用。SPF级雌性BALB/c小鼠随机分为对照组、哮喘组及哮喘+NAC处理组,每组5只。卵蛋白（OVA）诱导建立哮喘模型,用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测肺组织VDUP1 mRNA表达水平,免疫组化法检测VDUP1在肺组织的分布及蛋白表达情况。2.建立过氧化氢（H2O2）诱导正常人支气管上皮细胞（NHBE）非致死性和致死性氧化应激模型,研究VDUP1、TRX在HBE表达与定位情况。四唑盐（MTT）比色法检测不同H2O2浓度对NHBE株HBE135-E6E7（HBE）活力的影响;选择50μM、200μM和600μM处理HBE 24h,RT-PCR检测VDUP1/TRX及β-actin基因表达水平,免疫荧光技术检测VDUP1/TRX蛋白表达水平及细胞内定位情况。Hoechests33342检测细胞凋亡情况。分析细胞凋亡与VDUP1、TRX表达相关关系。比较不同浓度H2O2对VDUP1、TRX表达的影响。比较VDUP1及TRX在HBE对氧化应激的反应性,并初步明确其协同作用。3.构建VDUP1 RNA干扰（siRNA VDUP1）质粒,观察siRNA VDUP1后对细胞生长、凋亡的影响及在氧化应激耐受中的作用。siRNA VDUP1质粒构建、转染,转染效率通过免疫荧光鉴定,通过RT-PCR和Western blot方法检测干扰效率。MTT法检测siRNA VDUP1后对HBE生长的影响,采用不同的H2O2浓度（50μM,200μM,400μM,600μM及10000μM）刺激干扰后HBE,Hoechest法检测不同浓度H2O2浓度对细胞凋亡的影响。4.研究VDUP1在H2O2诱导HBE VEGF表达作用及可能机制。首先用不同浓度H2O2（50μM、200μM、600μM）在无血清培养条件下处理HBE 24小时。RT-PCR法检测HBE VEGF mRNA表达,双抗体夹心ELISA法检测H2O2诱导HBE VEGF表达及PI3K拮抗剂Ly294002（10μM）对VEGF表达的影响。在确认H2O2可以PI3K依赖性促进VEGF表达基础上,免疫荧光检测Ly294002（10μM）对50μM H2O2诱导HBE VDUP1/TRX及VDUP1/Jab1表达及定位的影响。ELISA法检测正常组、空质粒转染组及siRNA VDUP1组H2O2诱导HBE VEGF表达情况,探讨VDUP1在H2O2诱导HBE VEGF表达作用及可能机制。结果:1.VDUP1在哮喘肺组织表达明显增加,而NAC进一步增加VDUP1表达。VDUP1主要定位在AEC和少量间充质细胞。成功建立哮喘小鼠模型,肺组织中VDUP1 mRNA相对表达在对照组,哮喘组和NAC处理组分别为0.633±0.055,0.922±0.052,1.07±0.076;相对于对照组,哮喘组和NAC处理组的VDUP1表达显著增加（n=5,P＜0.001）;NAC组相对于哮喘组,表达也显著增加（n=5,P＜0.001）。免疫组化染色可见VDUP1主要分布于支气管及肺泡上皮细胞胞浆,在细胞核及胞膜也可见。正常组、哮喘组及NAC处理组灰度值分别为:66.74±2.98,77.94±3.23,98.38±7.31。相对于正常组,哮喘组VDUP1表达显著增强（n=5,P=0.004）,相对于正常组和哮喘组NAC组显著增加（n=5,P＜0.001）。2.H2O2可以增加HBE VDUP1/TRX表达,在更低浓度可以促进VDUP1表达,同时促进两者向细胞核及细胞膜转位。VDUP1和TRX荧光表达强度与细胞凋亡呈正相关。建立H2O2诱导的致死性和非致死性氧化应激诱导HBE研究模型。在200μM以下H2O2处理24h对细胞活力无显著影响。正常、50μM H2O2、200μM H2O2、600μMH2O2分别处理24h后,VDUP1 mRNA相对表达在四组中分别为0.355±0.031,0.453±0.047,0.414±0.047,0.507±0.067;TRX mRNA表达在四组中分别为:0.366±0.076,0.386±0.045,0.446±0.083,0.677±0.025。相对于对照组,VDUP1在50μM H2O2（n=6,P=0.008）,200μM H2O2（n=6,P=0.012）,600μM H2O2（n=6,P＜0.001）各处理组均显著增加,且随浓度增加而增加。TRX表达只在600μM组表达显著性增加（n=6,P=0.04）;免疫荧光检测VDUP1/TRX主要在细胞胞浆分布,VDUP1与TRX共定位,在50μM H2O2处理下,两者荧光强度增加,VDUP1,TRX明显向细胞膜转位,部分细胞向核内转位。细胞处于凋亡状态时两者荧光强度均明显增强。3.siRNA VDUP1转染后对正常HBE生长无显著影响,但在氧化应激作用下,可以减少较高浓度H2O2引起HBE的凋亡率。siRNA VDUP1转染HBE效率:约80%。siRNA VDUP1mRNA和蛋白水平干扰效率约分别约60%和50%。正常组,空质粒阴性照组、脂质体组及siRNAVDUP1组对细胞生长均无显著影响。Hoechest 33342检测siRNA VDUP1 24h后HBE凋亡无显著影响。50μM、200μM两浓度对siRNA VDUP1后HBE凋亡无显著影响。400μM、600μM及1000μM H2O2处理组干扰前后HBE凋亡百分率分别为:（22.333±2.081,14.333±2.082,n=3,P=0.009）,（36.000±1.826,25.000±3.000,n=3,P=0.002）,（44.333±4.041,35.000±3.000,n=3,P=0.033）。VDUP1 siRNA干扰组均可显著减少HBE凋亡。4.VDUP1参与H2O2诱导HBE VEGF表达的作用及可能机制。①H2O2可以显著增加HBE VEGF表达,Ly294002（10μM）可以完全拮抗这种效果。HBE135-E6E7组成性表达VEGF189和VEGF165两个亚型。VEGF165/β-actinmRNA在正常组、50μM、200μM及600μM H2O2相对表达分别为0.379±0.044,0.791±0.042,0.585±0.133,0.720±0.0213。VEGF189/β-actin mRNA相对表达在四组中分别为:0.193±0.018,0.270±0.012,0.205±0.074,0.302±0.035。相对于对照组,VEGF165、VEGF189在50μM H2O2处理组即可显著升高VEGF表达（n=6,P＜0.001）,但并无浓度依赖性增加。ELISA结果显示:正常组、50μM H2O2处理组和Ly294002（10μM）预处理后加50μM H2O2处理组,上清VEGF浓度分别为:591.5±9.5 pg/ml,768.9±21.3 pg/ml,489.3±10.9 pg/ml。H2O2处理组显著升高VEGF表达（n=4,P＜0.001）,而Ly294002可显著降低H2O2诱导的VEGF表达（n=4,P＜0.001）,甚至比正常水平更低（n=4,P＜0.001）②Ly294002（10μM）对VDUP1/TRX/Jab1表达无显著影响,免疫荧光显示可以减少VDUP1向细胞膜和细胞核转位,对Jab1、TRX表达及定位情况未见显著影响。相对于H2O2处理组,Ly294002预处理组对VDUP1、TRX表达未见显著差异,但Ly294002处理下VDUP1向细胞膜和细胞核聚集减少,但对TRX细胞膜定位未见明显影响。Jab1在正常HBE弥散分布在胞浆中,与VDUP1无共定位情况。在H2O2处理24h后,Jab1荧光强度稍增加,Jab1明显向细胞核或核膜聚集,在细胞核可见与VDUP1存在明显的共定位情况。Ly294002处理后,对VDUP1、Jab1表达荧光强度未见明显改变,两者仍存在共定位。③siRNA VDUP1可以稍增加H2O2诱导HBE VEGF表达,但尚无统计学意义。正常对照组,50μM H2O2处理组,空质粒转染后50μM H2O2处理组及siRNAVDUP1后50μM H2O2处理组上清VEGF浓度分别为:587.1±12.1 pg/ml,740.1±12.8 pg/ml,748.9±22.5 pg/ml,759.8±8.4 pg/ml。H2O2处理组相对于正常组均有显著差异（n=4,P＜0.001）。siRNAVDUP1后H2O2处理组浓度稍增加,但统计学上无显著差异（n=4,P=0.085）结论:1.VDUP1与哮喘氧化应激有关,可能作为抗氧化的标志之一。2.VDUP1可能是调节HBE氧化应激及耐受的重要因素,在HBE氧化应激信号通路中发挥着重要调控作用,VDUP1和TRX可能协同参与氧化应激过程。3.H2O2可PI3K依赖性促进VEGF表达。PI3K及其通路参与了VDUP1的转位过程,在氧化应激HBE模型中VDUP1、TRX及Jab1可能存在协同作用,但VDUP1是否参与H2O2诱导VEGF表达及确切调控机制尚待深入探讨。
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