大豆尿黑酸叶绿醇转移酶（HPT）基因的分离与功能分析

论文摘要

维生素E又称生育酚,是仅由光合生物合成的一类脂溶性的强抗氧化剂,为人体所必需的维生素之一,它可以清除生物体内的活性氧和自由基。因此,食用维生素E可以增强机体免疫功能,具有防衰老、防癌、减缓多种恶性疾病（白内障、神经紊乱、心血管疾病等）及润肤美容的作用。但是,在植物当中生育酚的含量又普遍较低,因此,采用基因工程技术手段提高植物当中的生育酚的含量成为目前营养基因组学研究的热点。大豆尿黑酸叶绿醇转移酶处于维生素E生物合成途径的关键一步,它的作用是催化叶绿醇焦磷酸（phytyl-PP）与尿黑酸（HGA）缩合生成生育酚的前体。随着维生素E代谢途径的阐明以及相关基因的克隆,人们开始通过分子生物学技术研究如何提高植物中α-生育酚的含量。为探索利用基因工程手段提高总生育酚含量,本研究采用RT-PCR技术,从大豆中分离了尿黑酸叶绿醇转移酶的全长cDNA序列,该cDNA序列全长1200bp。为了进一步研究该基因的功能,我们得到了以下结果:1.提取大豆总RNA,利用RT-PCR技术,从大豆中分离了大豆尿黑酸叶绿醇转移酶（HPT）的全长cDNA序列。2.构建了大豆基因的植物表达载体pBI121-HPT,通过真空渗透法转化拟南芥,获得转基因植株35株,PCR检测阳性率是51.2%。通过自交和抗性筛选标记获得了转基因纯系植株。3.利用HPLC测定转基因植株的总生育酚含量,结果显示,转基因植株的总生育酚含量普遍高于野生型植株,提高3-6倍。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 天然维生素E 研究进展
• 1.1.1 天然维生素E 的结构及分类
• 1.1.2 天然维生素E 的合成部位及分布
• 1.1.3 天然维生素E 的功能与应用
• 1.1.4 天然维生素E（α-生育酚）生物合成途径研究进展
• 1.1.5 天然维生素E 生物合成的调控和基因工程
• 1.2 植物逆境与维生素E
• 1.3 植物遗传转化研究进展
• 1.3.1 植物遗传转化的优点
• 1.3.2 植物遗传转化方法
• 1.4 模式植物拟南芥的遗传转化研究进展
• 1.4.1 拟南芥的生物学特性
• 1.4.2 拟南芥的遗传转化方法
• 1.5 研究背景及意义
• 1.6 实验设计
• 第二章 大豆HPT 基因克隆
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 载体
• 2.1.3 工具酶
• 2.1.4 化学试剂
• 2.1.5 实验设备
• 2.1.6 常用的溶液和缓冲液
• 2.1.7 引物及DNA 合成及测序
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 大豆叶片总RNA 的提取（Trizol 法）
• 2.2.2 反转录反应（TOYOBO 试剂盒）
• 2.2.3 获得大豆HPT 基因的部分cDNA 序列
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 大豆中总RNA 的提取及电泳
• 2.3.2 大豆HPT 基因全长序列的获得
• 第三章 大豆HPT 基因转基因拟南芥的获得及功能分析
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌种和植物实验材料
• 3.1.2 载体
• 3.1.3 工具酶
• 3.1.4 试剂盒
• 3.1.5 测序和引物合成
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 植物稳定转化表达载体 pBI121-HPT 的构建
• 3.2.2 农杆菌LBA4404 电击感受态细胞的制备和农杆菌转化
• 3.2.3 农杆菌质粒DNA 的提取
• 3.2.4 拟南芥转化（Floral Dipping）法
• 3.2.5 抗性筛选转基因植株
• 3.2.6 转基因植株PCR 检测
• 3.2.7 纯系转基因植株的获得
• 3.2.8 纯系转基因拟南芥的Northern blotting 分析
• 3.2.9 转基因拟南芥生育酚的测定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 植物转化表达载体 pBI121-HPT 的构建
• 3.3.2 农杆菌转化
• 3.3.3 拟南芥的转化
• 3.3.4 转基因拟南芥的Northern blotting
• 3.3.5 转基因拟南芥维生素E 的测定
• 第四章 结论
• 参考文献
• 附录I
• 附录II
• 致谢