论文摘要
本研究率先研究建立的鲤鱼（Cyprinus carpio）悬浮原代肠上皮细胞（IECs）研究模型,进一步利用该研究模型结合同位素示踪技术,分子克隆、生物信息学和荧光定量方法,克隆了IECs谷氨酰胺酶（GLS）和蛋白合成信号调控分子雷帕霉素靶（TOR）基因cDNA序列,研究了GLS和TOR基因在鲤鱼肠道不同部位的表达及GLS活力分布,探索了Gln对鲤鱼肠道不同肠段IECs蛋白质合成能力的影响及机理。结果如下:1.研究建立了鲤鱼悬浮原代IECs研究模型。结果表明:分离鲤鱼IECs呈圆形,可见明显两极特征,纯度95%,活力93%,分离IECs提取的DNA纯度更高,提取的总RNA结构完整。结果表明:该模型可应用于PCR分子生物实验研究。2.克隆了鲤鱼IECs GLS基因cDNA序列。该序列长1788bp,包含从起始密码子1位到末端终止密码子1788位的开放阅读框,编码595个氨基酸残基的GLS蛋白前体,分子量65.96kDa。核苷酸序列与斑马鱼的相似性为89.9%,与原鸡的相似性为69.4%,与小鼠K-和L-GLS的相似性分别为70.2%和65.2%,与大鼠K-和L-GLS的相似性分别为70.4%和65.9%,与人K-和L-GLS的相似性分别为69.8%和64.3%。蛋白质结构分析表明:鲤鱼GLS氨基酸残基序列含有两个非常保守的区域,分别为171～457位氨基酸残基的GLS蛋白家族区域和484～570位氨基酸残基的锚定蛋白重复序列;氨基酸残基中118、355、409、438和502位的丝氨酸残基磷酸化位点,205位的苏氨酸残基磷酸化位点和393、511位的酪氨酸残基磷酸化位点高度保守,是GLS蛋白功能调控位点;含有10个高度保守的半胱氨酸残基,位于GLS蛋白家族区域和锚定蛋白重复序列,与GLS蛋白分子结构稳定性和亚细胞定位密切相关。3.克隆了鲤鱼IECs TOR基因cDNA序列。该序列长7548bp,包含从起始密码子1位到末端终止密码子7548位的开放阅读框,编码2515个氨基酸残基的TOR蛋白,分子量为286.03kDa。核苷酸序列与斑马鱼相似性为92.0%,与原鸡相似性为78.0%,与鸭嘴兽、小鼠和大鼠相似性分别为74.5、78.4和78.5%,与人相似性为78.6%。蛋白质结构分析表明:鲤鱼TOR蛋白的1～348氨基酸残基为HEAT重复序列;349～2515位氨基酸残基为PIKKs蛋白质家族结构域,包括1365～1948位的FAT结构域,1985～2078位的FRB结构域（FKBP12-RAP复合物结合区域）,2119～2397位的激酶催化区域,2485～2515位的FATC结构域,这些结构域序列非常保守,对TOR蛋白空间构象和生物活性非常重要;N-端931～1039氨基酸残基序列含有内质网和高尔基体的定位序列,对TOR蛋白定位于内质网和高尔基体膜非常重要。4.研究了鲤鱼不同肠段谷丙转氨酶（AlaAT）、谷草转氨酶（AspAT）、谷氨酸脱氢酶（GDH）、苹果酸脱氢酶（MDH）和乳酸脱氢酶（LDH）活力大小。结果表明:AlaAT活力,5肠段显著高于其它各肠段（P＜0.05）,3肠段显著高于1～2、4和6～7肠段（P＜0.05）,2、4肠段显著高于1、6～7肠段（P＜0.05）,1与6～7肠段差异不显著（P＞0.05）:AspAT活力,2肠段显著高于其它各肠段（P＜0.05）,3～5肠段显著高于1、6～7肠段,1与6～7肠段差异不显著（P＞0.05）:GDH活力,3肠段显著高于其它各肠段（P＜0.05）,2与4～6肠段差异不显著（P＞0.05）,但显著高于1、7肠段（P＜0.05）,1与7段差异不显著（P＞0.05）;MDH活力,3肠段显著高于其它各肠段（P＜0.05）,2肠段显著高于1、4～7肠段（P＜0.05）,4肠段显著高于1、5～7肠段（P＜0.05）,1与5肠段差异不显著（P＞0.05）,但显著高于6～7肠段（P＜0.05）,6与7肠段差异不显著（P＞0.05）;LDH活力,2肠段显著高于其它各肠段（P＜0.05）,4肠段显著高于1、3和5～7肠段（P＜0.05）,3肠段显著高于1、5～7肠段（P＜0.05）,1与5～7肠段差异不显著（P＞0.05）。结果说明:AlaAT、AspAT、GDH、MDH和LDH活力均以鲤鱼中肠（2～5肠段）较高。5.研究了鲤鱼不同肠段GLS活力大小和基因表达。结果表明:不同肠段GLS活力,3～4肠段显著高于1～2肠段和6～7肠段（P＜0.05）,5肠段显著高于1、6～7肠段（P＜0.05）,2肠段显著高于1、7肠段（P＜0.05）,6肠段显著高于1、7肠段（P＜0.05）,1肠段显著高于7肠段（P＜0.05）,5、2～4肠段之间及2、6肠段之间差异不显著（P＞0.05）。不同肠段GLS mRNA表达量,3～4肠段显著高于7肠段（P＜0.05）,其余各肠段差异不显著（P＞0.05）,其分布规律与GLS活力基本相同。结果说明:鲤鱼中肠（2～5肠段）GLS活力和mRNA表达量均较高。6.研究了生长期不同体重鲤鱼不同肠段TOR基因表达量。结果表明:1肠段,18.1g组TOR mRNA相对表达量显著低于其它各体重组（P＜0.05）,18.1、31.1g组之间以及40.6、58.0、73.9g组之间差异不显著（P＞0.05）;2～5肠段和6～7肠段,18.1g和31.1g组TOR mRNA相对表达量显著低于其它各体重组（P＜0.05）,18.1、31.1g组之间以及40.6、58.0、73.9g组之间差异不显著（P＞0.05）。40.6、58.0、73.9g组TOR mRNA相对表达量各肠段之间差异不显著（P＞0.05）,但是18.1g组1肠段显著高于6～7肠段,31.1g组1肠段则显著高于2～5肠段和6～7肠段（P＜0.05）。结果说明:随体重增加,鲤鱼肠道TOR mRNA表达量增加,同时在幼龄阶段（30g前）前中肠表达量高。7.研究了鲤鱼肠道不同肠段IECs蛋白质合成能力及Gln对不同肠段IECs合成能力的影响。结果表明:蛋白质合成率2～3肠段显著高于其它各肠段（P＜0.05）,1肠段显著高于4～7肠段（P＜0.05）,4肠段显著高于5～7肠段（P＜0.05）,5～7肠段差异不显著（P＞0.05）;1mg/L Gln组1～3肠段IECs蛋白质合成率显著高于0mg/L Gln组（P＜0.05）,但4～7肠段则差异不显著（P＞0.05）。结果说明:鲤鱼前中肠（1～3肠段）蛋白合成能力高于后肠（5～7肠段）,Gln可提高前中肠（1～3肠段）IECs蛋白质合成能力。8.TOR抑制剂RAP、GLS抑制剂DON和Gln对鲤鱼IECs蛋白质合成的影响。结果表明:1mg/L Gln组蛋白质合成率显著高于0mg/L Gln组（P＜0.05）;1mg/L Gln+RAP、1mg/L Gln+DON和1mg/L Gln+RAP+DON组均显著低于1mg/L Gln组（P＜0.05）,高于0mg/L Gln组（P＜0.05）;1mg/L Gln+DON组显著高于1mg/L Gln+RAP和1mg/L GlnRAP+DON组（P＜0.05）;1mg/L Gln+RAP组显著高于1mg/L Gln+RAP+DON组（P＜0.05）。结果说明:GLS和TOR信号分子参与了Gln提高鲤鱼IECs蛋白质合成的调控。9.研究了Gln对鲤鱼IECs GLS基因表达的影响。结果表明:30～120min,1mg/L Gln组GLS mRNA相对表达量显著高于0mg/LGln组（P＜0.05）;1mg/LGln组中,120min GLSmRNA相对表达量显著低于70min（P＜0.05）,与30min差异不显著（P＞0.05）:0mg/LGln组中,30～120min,GLS mRNA相对表达量差异不显著（P＞0.05）。结果说明:Gln促进了鲤鱼IECs GLS基因表达。10.研究了Gln、TOR抑制剂RAP和GLS抑制剂DON对鲤鱼IECs TOR基因表达的影响。结果表明:1mg/L Gln组IECs TOR mRNA相对表达量显著高于0mg/L Gln组（P＜0.05）;1mg/L Gln+RAP组显著低1mg/L Gln组（P＜0.05）,与0mg/L Gln差异不显著（P＞0.05）;1mg/L Gln+DON组与1mg/L Gln差异不显著（P＞0.05）,但显著高于1mg/LGln+RAP组和0mg/L Gln组（P＜0.05）。Gln作用时间,15min,30min组IECs TOR mRNA相对表达量显著高于5min组（P＜0.05）;30min与15min组之间差异不显著（P＞0.05）。结果说明:Gln可通过TOR信号分子调控TOR基因表达,提高了TOR mRNA表达量;GLS没有参与Gln对鲤鱼IECs TOR基因表达的调控过程。综上所述:在鲤鱼肠道存在IECs蛋白合成信号调控分子TOR,随着体重增加,TORmRNA在肠道中表达量逐步增加,30g前幼龄鲤鱼前中肠表达量高;鲤鱼前中肠IECs蛋白质合成能力强;Gln提高前中肠IECs蛋白质的合成能力,Gln提高其蛋白质合成能力受到TOR和GLS的调控。
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