论文摘要
背景:近年来,随着干细胞工程的兴起,骨髓间充质干细胞在治疗缺血性心脏病方面备受关注。研究表明,干细胞可以分化为心肌细胞、增加有功能的心肌细胞数量,增加心梗区域血管的密度,改善心功能,干细胞的存活依赖于所种植的微环境,移植到缺血心肌的干细胞存活率极低,严重制约了其疗效。实验证实低氧诱导因子-1α（ hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α）能明显抑制细胞的凋亡,虽然缺氧心肌能够产生HIF-1α,但由于降解极快,难以在心肌缺血缺氧中发挥作用。因此我们运用双定点基因突变的方法重组HIF-1α,转染干细胞,研究在体内外的缺氧条件下,基因突变的HIF-1α能否抑制干细胞的凋亡,提高治疗效果,并在此基础上进一步探讨干细胞自体移植联合基因转染治疗缺血性心肌病的机理。第一部分猪骨髓间充质干细胞（MSCs）的分离、培养和心梗模型的建立目的:从猪的骨髓中分离出具有多向分化潜能的骨髓间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）以及建立猪的心梗动物动物模型。第一节猪骨髓间充质干细胞（MSCs）的分离、培养目的:建立猪骨髓间充质干细胞体外培养方法,为细胞心肌成形术提供新材料。方法:猪的骨髓MSCs分离纯化后,流式细胞仪检测细胞周期。结果:体外培养的原代MSCs 10～14d达到融合,细胞周期显示73%的细胞处于G0/G1期。结论:根据黏附特性分离的猪骨髓MSCs在体外条件下可生长扩增,可用于细胞心肌成形术。第二节猪心肌梗死模型的建立目的:经心导管用明胶海绵栓子栓塞猪的冠状动脉左前降支（LAD）,建立心肌梗死的模型。方法:麻醉后经股动脉置入心导管至冠状动脉左前降支远端用明胶海绵栓塞LAD。8周后行血流动力学、核磁共振、冠状动脉造影及组织学检查。结果:与对照组相比,心梗（MI）组左室发展压（LVDP）降低（P<0.05）,±dp/dtmax下降（P<0.05）。与对照组相比,心梗（MI）组左室每搏量（SV）、舒张末期室壁厚度（EDWT）下降（P<0.05）。复查冠脉造影提示LAD栓塞仍存在。组织学检查MI组前室壁、室间隔形成了透壁梗死灶。结论:运用明胶海绵封堵冠状动脉成功建立猪心肌梗死模型,符合临床病理生理过程,稳定可靠。第二部分pcDNA3.1+-GCA-HIF-1α-GCC慢病毒表达载体构建目的:构建低氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1,HIF-1α）真核表达载体pcDNA3.1+-HIF-1α的突变体pcDNA3.1+-GCA-HIF-1α-GCC,并用慢病毒包装。方法:用定点突变的方法将pcDNA3.1+-HIF1α的HIF1α第567位脯氨酸HIF1αPro密码子CCA突变为丙氨酸（Ala）密码子GCA,构建成单个突变HIF1α真核表达载体pcDNA3.1+HIF1α-567Ala在第一次突变的基础上仍然用定点突变的方法将pcDNA3.1+- HIF1α-567Ala的第811位天冬酰胺（Asn）密码子AAT突变为丙氨酸（Ala）密码子GCC,构建成双定点突变HIF1α真核表达载体pcDNA3.1+-GCA-HIF-1α-GCC,重组成HIF1α慢病毒质粒,经酶切及测序鉴定正确后,在293细胞中包装成为重组HIF1α慢病毒,并进行PCR鉴定及滴度测定,以RT-PCR和Western blot法分别对转染细胞进行表达分析。结果:经酶切鉴定及基因测序证实人双突变型低氧诱导因子1α真核表达载体GCA-HIF-1α-GCC构建成功,PCR检测重组慢病毒包装成功,病毒滴度为2.5×108tu /ml。结论:成功构建慢病毒包装重组人双突变型低氧诱导因子1α真核表达载体GCA-HIF-1α-GCC,能稳定表达相应的蛋白和HIF-1αmRNA。第三部分慢病毒系统介导的GCA-HIF-1α-GCC基因转染猪骨髓干细胞及凋亡检测目的:观察慢病毒包装系统（pPACKH1-Lentivector Packaging Kit）介导的GCA-HIF-1α-GCC基因转染猪MSCs,细胞内GCA-HIF-1α-GCC表达情况以及对MSCs生长的影响,在低氧的环境中检测转GCA-HIF-1α-GCC基因的骨髓干细胞和原代细胞、转慢病毒空载体细胞的凋亡情况。方法:取生长良好的第2代MSCs接种,培养至生长汇合70-80%时,加入慢病毒载体GCA-HIF-1α-GCC,设定转染复数（multiplicities of infection,MOI ）为5,以只含GFP基因的空质粒进行对照。荧光显微镜观察绿色荧光。提取蛋白后进行western blot蛋白鉴定。用FITC- Annexin V和PI双染法行流式细胞仪分析比较MSCs凋亡,转慢病毒空载体的MSCs和转GCA-HIF-1α-GCC的MSCs三种细胞在1% O2 37℃的培养箱中培养24 h后细胞的凋亡和死亡情况。Western blot检测Bax、HO-1蛋白表达。结果:转染MSCs 48小时后,可检测到强荧光出现。Western blot免疫印迹技术表明HIF-1α蛋白表达产物的分子量与已知分子量相符。原代细胞在缺氧和乏营养状态下发生大量的凋亡,其凋亡率为61.3%,转空载体的细胞死亡率达67.3%,而转GCA-HIF-1α-GCC基因的MSC的凋亡率仅为7.1%。Western blot表明转基因的MSCs,HO-1蛋白表达增高而Bax表达降低。结论:使用携带目的基因GCA-HIF-1α-GCC的慢病毒系统转染猪的骨髓干细胞可使其稳定表达HIF-1α。转GCA-HIF-1α-GCC的MSCs在体外较MSCs更能耐受缺氧和乏营养所诱发的凋亡,其原因与HIF-1α稳定表达促使干细胞分泌HO-1抑制Bax有关。第四部分GCA-HIF-1α-GCC修饰自体骨髓干细胞移植治疗缺血性心肌病的实验研究目的:探讨转染GCA-HIF-1α-GCC基因的MSCs自体移植治疗缺血性心肌病的疗效及机理,为治疗缺血性心肌病提供新的方法。方法:选用15～20㎏梅山小型猪24头,随机分4组:A组:空白组、B组:DMEM组、C组:MSCs组和D组:转基因组,应用明胶海绵栓塞LAD建立心梗模型。采用密度梯度离心与贴壁筛选相结合的方法分离纯化、体外扩增MSCs,D组MSCs体外转染GCA-HIF-1α-GCC基因。干细胞（1×107/5 mL）经心导管注射到LAD栓塞处远端。分别于MSCs注射1周、2周、4周、6周和8周,行Powerlab及MRI检查,评估心功能和活体内干细胞标记情况,采用ELISA法检测血浆BNP、VEGF在梗死后和干细胞移植前后的变化;组织学观察各组移植细胞的情况,测算心梗面积,以及Western blot检测过氧化酶体增殖物激活型受体α（peroxisomeproliferator activated receptorα, PPARα）。结果:移植前,磁共振示梗死心脏的左室舒张末径（EDWT）增加,每搏量（SV）明显下降,血流动力学LVDP、±dp/dtmax下降明显。移植后,C、D组的心功能较移植前有改善（P<0.05）,移植的MSCs能防止梗塞区变薄和扩张;与A、B两组和移植前相比,梗死区的收缩功能和血流灌注均有所改善（P<0.05）,移植组的心梗面积缩小（P<0.05）;这种心功能的改善在D组更为明显（与C组比较,P<0.05）。Western blot检测PPAR,与A、B和C组相比, D组PPARα蛋白表达明显增加（P<0.05）。D组的增加比C组显著。与A、B两组相比,C、D组梗死区的毛细血管密度明显增加（P<0.05）,D组的增加比C组显著,同样比较,BNP降低明显（P<0.05）,D组的降低比C组显著。C、D组VEGF的水平在梗死后有所增加,在细胞移植后一周出现高峰,后逐渐下降。结论:MSCs能在宿主心肌组织中存活,通过防止梗死区变薄、抑制收缩功能异常而改善左室功能。GCA-HIF-1α-GCC转染MSCs可以使移植的干细胞更能耐受移植早期的缺氧和乏营养的微环境,减少细胞的凋亡,增加参与心肌修复的干细胞的绝对数量,从而可更加显著改善心脏功能,PPAR在其中起非常重要的作用。应用GCA-HIF-1α-GCC基因和MSCs自体移植是治疗缺血性心肌病的一种有效的方法。