果聚糖转移酶基因的克隆及功能分析

论文摘要

果聚糖是高等植物的一种储藏性碳水化合物,定位于植物细胞的液泡中,其解聚释放可降低组织水分冰点的游离果糖,起到液泡渗透缓冲剂和低温防护剂的作用,可以增强植物的抗旱性和抗寒性。本研究克隆了枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）果聚糖合酶的sacB基因,序列分析与Ebskamp公布的果聚糖合酶基因氨基酸序列同源性为100%,以PBI121为载体,构建植物表达载体pBI-sacB,使sacB基因置于CaMV35s启动子调控下。用农杆菌介导的叶盘法转化烟草,获得转基因植株。转基因烟草试管苗长势良好,移栽室外,随着烟草的不断长大,叶片出现明显的黄斑及叶坏死现象。推测在细胞质表达的sacB基因产物,干扰了植物正常的生理功能,造成果聚糖的有害积累。鉴于植物原本在液泡合成和积累果聚糖,本研究将sacB基因与甘薯sporamin基因定位于液泡的引导肽序列融合,构建植物表达载体pBI-sp-sacB,使sacB基因的表达产物定向运输到液泡中。通过遗传转化,得到正常生长的转基因烟草植株。利用Trizol试剂盒提取洋葱RNA,通过RT-PCR的方法,获得洋葱SST基因的CDNA序列。测序结果与GenBank公布的洋葱SST基因氨基酸同源性为99%。利用组成型植物表达载体pBI121,构建植物表达载体pBI-SST。将pBI-SST通过农杆菌介导的方法转化烟草,对转化植株进行分子鉴定和果聚糖转移酶活性的测定。结果表明:转基因烟草葡萄糖的含量明显高于非转基因烟草,说明克隆的果聚糖转移酶的基因已经成功的整合到烟草基因组中,同时在转基因烟草中能正确表达。用PEG6000模拟干旱,胁迫转基因烟草叶片,测定细胞膜的透性。表明:转基因烟草相对电导率明显低于非转基因烟草,本研究只是初步结果,获得的转基因烟草能够增强植物对水分胁迫能力,显示了潜在的应用价值。另外,洋葱SST基因的功能分析还未见报道。因此,本研究为下一步对SST基因的功能分析打下了基础。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 英文缩写词表
• 前言
• 文献综述
• 一、材料与试剂
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 常用酶和生化试剂
• 1.3 植物材料
• 1.4 主要仪器设备
• 二、实验方法
• 2.1 模板的获得
• 2.2 引物的设计
• 2.3 目的基因的克隆与测序
• 2.4 植物表达载体的构建
• 2.5 sacB 基因的原核表达
• 2.6 农杆菌工程菌的构建
• 2.7 癌农杆菌介导的烟草的转化和再生
• 2.8 转基因烟草的分子检测
• 2.9 果聚糖转移酶活性的测定
• 2.10 转基因烟草电导率的测定
• 三、实验结果
• 3.1 目的基因和融合基因的扩增及鉴定结果
• 3.2 植物表达载体的构建及重组子的鉴定
• 3.3 sacB 基因的原核表达
• 3.4 植物表达载体转化农杆菌及重组子的鉴定
• 3.5 烟草的转化和转基因植株的筛选
• 3.6 转基因烟草的PCR检测及RT-PCR表达
• 3.7 转基因烟草果聚糖转移酶活性的测定
• 3.8 转基因烟草电导率的测定
• 四、结论
• 五、讨论
• 5.1 关于引导肽和SACB 基因
• 5.2 关于PBI-SACB 与PBI-SP-SACB 表达载体
• 5.3 关于SST 基因
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 作者简介
• 石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表