论文摘要
背景与目的肺癌是目前全世界最常见的呼吸系统恶性肿瘤,近些年来其发病率和死亡率呈逐年上升趋势,已成为严重威胁人类健康的疾病之一。肺癌发病的主要机制是各种致癌物通过不同的方式诱发呼吸道上皮细胞DNA的损伤,导致一些相关基因的变化,从而导致细胞遗传信息的改变、细胞转化和癌变。激活蛋白-1（activator protein 1,AP-1）是一种顺序特异性转录激活因子,由Jun、Fos或激活转录因子（FAT）家族成员组成,并参与组成许多同型或异型二聚体,这些二聚体结合于相同的位点—AP-1结合位点[佛波酯应答元件（TRE）]。研究表明AP-1蛋白,尤其是属于Jun家族的蛋白,可以通过调控细胞周期调节因子,例如p53、p21、p19和p16的表达和活性改变来调控细胞的生存和死亡。染色质免疫沉淀技术（Chromatin immunoprecitation,ChIP）是一种广泛使用的在体内研究DNA和蛋白质相互作用的方法,既可证明特定的蛋白是否结合在一段特异的DNA序列上,也可证明特异的DNA序列否结合有特定的蛋白。研究转录因子和基因启动子的活性的传统方法,有报告基因分析、EMSA和DNA微阵列的方法。但是它们都是在体外研究DNA和蛋白质相互作用的方法。而ChIP能证明活细胞内一个特定的蛋白是否结合在该细胞中一段特异的DNA序列上。免疫组化研究分析表明AP-1、周期蛋白CyclinD1和caspase3在非小细胞肺癌中表达均升高,推测AP-1作为转录因子可能对周期蛋白CyclinD1和caspase3起作用,从而在非小细胞肺癌的形成和发展中发挥重要作用。但是,缺乏直接证据。本研究将利用ChIP技术,观察AP-1（c-jun）抗体免疫沉淀的染色质片段是否含有CyclinD1和caspase3基因片段,为在生理条件下肺腺癌A549细胞中AP-1是否参与了CyclinD1和caspase3基因表达的调控提供直接证据。材料和方法1细胞选用人Ⅱ型肺泡上皮细胞A549细胞,常规细胞培养方法培养A549细胞2染色质免疫沉淀（ChIP）实验2.1生理条件下甲醛固定及A549细胞核染色质的分离加入270μl 37%甲醛至终浓度1%,轻轻摇匀,室温放置10min。加入10ml甘氨酸终止固定液,轻轻摇匀,室温放置5min,倾去甘氨酸终止固定液,10ml预冷PBS漂洗,加入1ml预冷细胞刮除液,用细胞刮刀剥落细胞,4℃2800rpm离心3min,弃上清,收集沉淀细胞。重悬浮细胞,加入1ml预冷细胞裂解液,将液体平均分至330μl/管,备用。2.2超声破碎将交联的DNA打碎成200～1000bp,超声条件需要优化。2.3超声剪切效果检测2.4染色质里非特异性抗体的清除每个离心管加60μl Protein G凝胶磁珠,4℃放摇床1h,6500rpm离心1min,收集上清液约1ml于1新离心管中。2.5染色质免疫沉淀在3个加有清除非特异性抗体后的染色质离心管里分别加入4.0μg相应的抗体（阳性对照乙酰化组蛋白H3抗体,阴性对照正常兔IgG及c-jun抗体）,4℃放摇床过夜。分别在3管抗体/染色质复合物里加入60μl Protein G凝胶磁珠。4℃放摇床1h。6500rpm离心1min,弃上清。然后常规洗涤。2.6蛋白质/DNA复合物的洗脱加100μl洗脱液入含有抗体/DNA复合物的管中,轻轻混匀。室温放置15min。6500rpm离心1min,收集上清于1新离心管中。重复操作一次使新离心管中总量达200μl。2.7 DNA的去交联在收集到的3管200μl洗脱液和1管Input中分别加入8μl 5M NaCl,65℃水浴孵育过夜去交联,然后分别加入1μl RNase A,37℃孵育30min。最后分别加4μl0.5M EDTA,8μl 1M Tris-Hcl和1μl蛋白酶K溶液,45℃孵育2h。2.8 DNA纯化3 PCR检测结果以c-jun抗体免疫沉淀的染色质片段提取的DNA为模板,PCR扩增Caspase3基因5’区150bp片段（21-220）及CyclinD1基因5’区218bp片段（5-158）,结果显示模板中没有Caspase3基因5’区150bp片段,而含有CyclinD1基因5’区218bp片段DNA。结论1.本研究以c-jun抗体免疫沉淀c-jun蛋白结合的染色质片段,然后PCR扩增caspase3和CyclinD1基因,结果扩增出了CyclinD1基因特异片段,证实c-jun蛋白结合于CyclinD1基因的调控区,为c-jun参与CyclinD1基因的表达调控提供了有利的直接证据,亦为AP-1作为转录因子在非小细胞肺癌的形成和发展中起重要作用提供了依据。2.本研究没有扩增出caspase3基因的特异片段,即Caspase3基因转录启动子附近没有c-jun的结合位点,无法确定c-jun直接参与caspase3基因的表达调控。
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