南极适冷菌Pseudoalteromonas sp. S-15-13胞外多糖的研究

论文摘要

南极海洋环境寒冷,一些区域终年覆盖冰雪。空间的特殊性和每年海冰形成活动中季节的大幅浮动,使微生物栖息环境具有高度的多样性,进而形成了不同的微生物群落。生存于南极生态系统中的微生物的多样性是开发具有特殊应用价值的活性物质（包括EPSs）的资源库。南极海冰中发现了大量的微生物（海冰微藻和细菌）及其产生的胞外多糖,这些物质聚集在冰藻和细菌生存的海冰通道中,提供了海冰和冰水界面的有机碳,是能源传输的主要物质;并且还可以保护细胞在结冰时免受冰晶的伤害,缓冲pH以及盐浓度的变化,可以降低其它化学物质的伤害。南极微生物的胞外多糖在南极生态系统中具有重要的意义,然而,南极微生物胞外多糖的免疫活性和潜在的生物生化应用价值尚未见报道。因为一些胞外多糖具有重要的生物及医用价值,如潜在的抗肿瘤、免疫调节以及降血糖等特性。为此寻找分泌特殊应用价值胞外多糖的微生物（包括极地微生物）的工作已经广泛展开。本研究以中国第十九次南极科学考察采集的海水海冰样品中的57株南极细菌为材料,通过胞外多糖的染色方法筛选出27株产糖菌;其中一株高产糖南极海洋菌S-15-13经16S rDNA鉴定确定为假交替单胞菌属;通过对该菌的培养条件的研究以及对其胞外多糖的分离纯化获得纯度较高的样品;采用气相色谱（GC）、红外光谱（IR）、甲基化分析、1维和2维核磁共振氢谱（1H-NMR）、碳谱（13C-NMR）分析确定多糖EPS-Ⅱ的结构;对多糖EPS-Ⅱ的体外免疫活性以及对荷瘤（S180）小鼠的免疫增强作用进行研究;对该胞外多糖的低温适应机制以及低温保护作用进行初步探讨,以期为南极细菌的适冷机制以及南极资源的开发利用提供科学依据。1.通过对57株南极菌的外形观察结合CHRISTENSEN法、刚果红法和显微镜检测法共筛选出产胞外多糖的菌株27株。16S rDNA鉴定结果表明,南极海洋菌S-15-13是一株假交替单胞菌Pseudoaltermonas sp. S-15-13。由于假交替

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 多糖的免疫调节作用
• 1.1.1 对免疫细胞的调节
• 1.1.2 激活网状内皮系统
• 1.1.3 对补体系统的作用
• 1.1.4 对细胞因子的调节
• 1.2 多糖作用机制
• 1.2.1 多糖作用的受体
• 1.2.2 细胞信息传导
• 1.2.3 多糖对基因表达的影响
• 1.3 活性多糖的构效关系
• 1.3.1 单糖组成
• 1.3.2 糖苷键类型
• 1.3.3 溶解度和粘度
• 1.3.4 取代基
• 1.3.5 分子量
• 1.3.6 核心寡糖片段
• 1.3.7 高级结构
• 1.4 细菌胞外多糖
• 1.4.1 胞外多糖的概念
• 1.4.2 胞外多糖的物理性质
• 1.4.3 胞外多糖的化学性质
• 1.4.4 胞外多糖的功能
• 1.4.5 革兰氏阴性菌胞外多糖的结构
• 1.4.6 革兰氏阴性菌胞外多糖结构和功能的关系
• 1.4.7 胞外多糖的合成机制
• 1.4.8 重要的细菌胞外多糖及其应用
• 1.5 南极微生物胞外多糖的研究进展
• 2 产胞外多糖南极海洋菌的分离筛选和菌种鉴定
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 基础培养基
• 2.1.3 试剂
• 2.1.4 仪器设备
• 2.1.5 产胞外多糖南极细菌的筛选
• 2.1.6 产胞外多糖南极海洋菌生理生化特性的鉴定
• 2.1.7 南极海洋菌S-15-13 总DNA 的提取
• 2.1.8 PCR 反应
• 2.1.9 琼脂糖电泳分析
• 2.1.10 DNA 序列的测定
• 2.2 结果
• 2.2.1 产胞外多糖南极海洋菌的筛选结果
• 2.2.2 5 株产糖南极海洋菌的生理生化鉴定结果
• 2.2.3 单菌落直接PCR 扩增结果
• 2.2.4 南极海洋菌S-15-13 的序列分析结果
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 3 南极海洋菌 S-15-13 产胞外多糖的实验室培养及100L 发酵条件
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 菌株
• 3.1.2 基础培养基
• 3.1.3 试剂和仪器
• 3.1.4 南极海洋菌 S-15-13 发酵液中还原糖的测定
• 3.1.5 南极海洋菌 S-15-13 发酵液中总糖和多糖的测定
• 3.1.6 不同培养条件下南极海洋菌 S-15-13 生长及多糖含量的测定
• 3.1.7 南极海洋菌S-15-13 100L 发酵条件
• 3.2 结果
• 3.2.1 不同培养时间下南极海洋菌S-15-13 的生长及多糖含量
• 3.2.2 不同碳源及不同浓度碳源下南极海洋菌S-15-13 生长和多糖含量
• 3.2.3 不同培养温度、起始pH 和NaCl 浓度下南极海洋菌S-15-13 生长和胞外多糖含量
• 3.2.4 南极海洋菌 S-15-13 放大培养生长进程以及多糖产量
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 4 南极适冷菌 S-15-13 胞外多糖的分离纯化及纯度鉴定
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 菌株
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 试剂和仪器
• 4.1.4 南极适冷菌 S-15-13 胞外多糖的提取
• 4.1.5 南极适冷菌胞S-15-13 胞外多糖脱蛋白方法的选择和蛋白质含量的测定
• 4.1.6 南极适冷菌 S-15-13 胞外多糖的分离纯化
• 4.1.7 南极适冷菌 S-15-13 胞外多糖的纯度鉴定
• 4.1.8 南极适冷菌 S-15-13 胞外多糖的理化性质分析
• 4.1.9 南极适冷菌 S-15-13 胞外多糖分子量的测定
• 4.1.10 南极适冷菌S-15-13 胞外多糖中糖含量的测定
• 4.2 结果
• 4.2.1 南极适冷菌S-15-13 胞外多糖脱蛋白方法的确定
• 4.2.2 南极适冷菌 S-15-13 胞外多糖的分离纯化结果
• 4.2.3 南极适冷菌S-15-13 胞外多糖纯度鉴定结果
• 4.2.4 南极适冷菌S-15-13 胞外多糖的分子量测定结果
• 4.2.5 南极适冷菌 S-15-13 胞外多糖的理化性质
• 4.2.6 南极适冷菌S-15-13 的糖含量
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 5 南极适冷菌 S-15-13 胞外多糖 EPS-Ⅱ的结构解析
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 样品
• 5.1.2 试剂
• 5.1.3 主要仪器
• 5.1.4 南极适冷菌S-15-13 胞外多糖的红外光谱的测定
• 5.1.5 南极适冷菌S-15-13 胞外多糖的单糖组成分析
• 5.1.6 甲基亚磺酰甲基钠的制备
• 5.1.7 南极适冷菌S-15-13 胞外多糖 EPS-Ⅱ的甲基化反应
• 5.1.8 全甲基化EPS-Ⅱ乙酰化反应及分析
• 5.1.10 南极适冷菌S-15-13 胞外多糖EPS-Ⅱ的二维核磁共振谱的测定..
• 5.2 结果
• 5.2.1 南极适冷菌S-15-13 胞外多糖红外光谱的特征峰
• 5.2.2 南极适冷菌S-15-13 胞外多糖单糖组成
• 5.2.3 南极适冷菌S-15-13 胞外多糖EPS-Ⅱ的甲基化分析的结果
• 5.2.4 南极适冷菌S-15-13 胞外多糖EPS-Ⅱ核磁共振谱的解析
• 5.2.5 南极适冷菌S-15-13 胞外多糖EPS-Ⅱ中甘露糖残基异头碳的构型.
• 5.3 讨论
• 5.4 小结
• 6 南极适冷菌 S-15-13 胞外多糖的免疫活性
• 6.1 南极适冷菌S-15-13 胞外多糖对脾淋巴细胞增殖的影响
• 6.1.1 实验动物
• 6.1.2 试剂和仪器
• 6.1.3 小鼠脾淋巴细胞增殖实验
• 6.1.4 小鼠腹腔MΦ吞噬功能实验
• 6.1.5 南极适冷菌 S-15-13 多糖 EPS-Ⅱ对小鼠肉瘤5180 的抑制实验
• 6.1.6 统计学处理
• 6.2 结果
• 6.2.1 小鼠脾淋巴细胞转化结果
• 6.2.2 小鼠吞噬细胞的吞噬试验结果
• 6.2.3 荷瘤小鼠体征状况
• 6.2.4 南极适冷菌S-15-13 胞外多糖EPS-Ⅱ对小鼠肉瘤5180 的抑制效果
• 6.2.5 南极适冷菌S-15-13 胞外多糖EPS-Ⅱ对荷瘤小鼠免疫器官重量的影响结果
• 6.2.6 南极适冷菌S-15-13 胞外多糖EPS-Ⅱ对荷瘤小鼠外周血WBC 水平的影响结果
• 6.2.7 南极适冷菌S-15-13 胞外多糖EPS-Ⅱ对荷瘤小鼠增殖细胞核抗原、脆性组氨酸三联体和S-100 阳性表达影响的结果
• 6.3 讨论
• 6.4 小结
• 7 南极适冷菌 S-15-13 胞外多糖的低温保护作用
• 7.1 材料和方法
• 7.1.1 菌株
• 7.1.2 基础培养基
• 7.1.3 南极适冷菌 S-15-13 胞外多糖低温保护作用的测定
• 7.1.4 南极适冷菌 S-15-13 胞外多糖降低冰点作用的测定
• 7.2 结果
• 7.2.1 南极适冷菌 S-15-13 胞外多糖的低温保护作用
• 7.2.2 南极适冷菌 S-15-13 胞外多糖的降低冰点作用
• 7.3 讨论
• 7.4 小结
• 8 结论
• 8.1 南极适冷菌S-15-13 的分离筛选及分类地位
• 8.2 南极适冷菌S-15-13 培养条件以及100L 发酵条件
• 8.3 南极适冷菌S-15-13 的分离纯化及分子量
• 8.4 南极适冷菌S-15-13 胞外多糖的单糖组成及其结构
• 8.5 南极适冷菌S-15-13 胞外多糖的免疫活性
• 8.6 南极适冷菌S-15-13 胞外多糖的低温保护作用
• 参考文献
• 致谢
• 发表文章