论文题目: 静脉注射用治疗基因靶向传递系统的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 药剂学
作者: 孙逊
导师: 张志荣
关键词: 基因治疗,非病毒载体,靶向传递,报告基因,白介素,脂质聚阳离子复合物
文献来源: 四川大学
发表年度: 2005
论文摘要: 随着人类基因组计划的完成和人类疾病相关基因的阐明,疾病的基因治疗备受瞩目。基因治疗的关键问题之一在于开发安全、高效的基因传输系统。目前,基因传输系统主要分为病毒载体系统和非病毒载体系统。病毒载体虽然具有较高的基因传递效率,但其临床应用存在着毒性和免疫原性等问题。因此,非病毒载体系统的研究成为另一重要的发展方向。非病毒载体具有使用方便、可大规模生产以及无免疫原性等优点,其中阳离子脂质体是研究应用得最为广泛的非病毒载体。但由于阳离子脂质体在体内的稳定性和靶向性较差,常常只能采取局部注射的给药方式。 为了构建一种可供静脉内注射的、具有靶向传输作用的基因载体,本文设计用由海洋鱼类提取的天然产物鱼精蛋白,作为聚阳离子材料缩聚质粒DNA,再让脂质体与缩聚后的DNA相互作用,从而使脂质双层重新排列,最终形成结构紧密的脂质-聚阳离子-DNA复合物(Lipid-polycation-DNA complexes, LPD)。 本研究中我们利用微生物发酵的方法大量培养转化有质粒的大肠杆菌,并采用阴离子柱层析的方法分离纯化质粒。采用紫外分光光度法和凝胶电泳法对质粒的纯度和含量进行了测定,纯度符合要求。 我们建立了用荧光染料Hoechst 33258来测定制剂中DNA含量的方法。采用薄膜-挤压法制备空白脂质体,然后与适量的鱼精蛋白-DNA复合物在室温孵育后,得到LPD;分别用单因素法和中心组合法优化了阳离子型LPD和阴离子型LPD的处方。 为了提高阳离子型LPD的物理化学及生物学稳定性,我们将其制备成冻干针剂。冻干后的LPD可以保持其结构的完整性。冻干后的LPD针剂外观饱满疏松,色泽均匀,表面细腻光洁,具有足够的强度;其粒径为132.5nm,Zeta电位为44.35mV,包封率为93.61%,微粒的形态和
论文目录:
中文摘要
英文摘要
第一章 绪论
第二章 质粒DNA的扩增和提取纯化
1． 仪器与试药
2． 实验方法
2．1 质粒DNA的扩增
2．2 质粒DNA的提取和纯化
2．3 质粒DNA的产量
2．4 质粒DNA的纯度分析
3． 讨论
第三章 脂质-聚阳离子-DNA复合物制备工艺的研究
第一节 DNA含量测定方法的建立
1． 仪器与试剂
2． 方法与结果
2．1 Hoechst 33258溶液的配制
2．2 荧光扫描
2．3 狭缝选择
2．4 标准曲线的绘制
2．5 LPD的回收率实验
2．6 LPD的重现性试验
3． 讨论
第二节 阳离子LPD的制备及其理化性质
1． 仪器与试剂
2． 实验方法
2．1 阳离子型LPD的制备
2．2 阳离子型LPD的理化性质
3． 实验结果
3．1 聚阳离子-DNA复合物的形成
3．2 LPD的形态粒径和Zeta电位
3．3 LPD的形态
3．4 LPD的包封率
3．5 LPD的抗核酸酶能力
4． 讨论
第三节 中心组合设计优化LPD的处方
1． 仪器于试剂
2． 实验方法
2．1 阴离子型LPD的制备
2．2 LPD的粒径和Zeta电位的测定
2．3 LPD的抗核酸酶能力的定量评价
2．4 确定实验范围
2．5 中心组合设计
2．6 数据处理
3． 结果和讨论
3．1 因素水平范围的确定
3．2 中心组合设计的试验结果
3．3 处方成分对LPD粒径的影响
3．4 处方成分对LPD抗核酸酶能力的影响
3．5 LPD的处方优化
第四章 脂质-聚阳离子-DNA复合物的体外细胞学实验
1． 仪器与试药
2． 实验方法
2．1 细胞复苏
2．2 细胞传代
2．3 细胞转染
2．4 转染率的测定
2．5 X-Gal染色
2．6 目的基因IL-12的检测
3． 实验结果
3．1 处方优化
3．2 转染率的比较
3．3 目的蛋白的表达
4． 讨论
第五章 阳离子LPD冻干针剂的研究
1． 仪器与试剂
2． 方法与结果
2．1 LPD冻干针剂处方与工艺研究
2．2 LPD冻干针剂质量评价
3． 结论与讨论
3．1 冻干后的LPD的基本特征
3．2 冻干保护剂的作用
3．3 冻干LPD针剂中DNA的完整性和抗核酸酶能力
第六章 阳离子LPD冻干针剂在小鼠体内的靶向性和药效学初步研究
第一节 阳离子LPD冻干针剂在小鼠体内靶向性的初步研究
1． 仪器与试药
2． 实验方法
2．1 给药
2．2 取材
2．3 固定和包埋
2．4 冰冻切片
2．S X-Gal染色
2．6 复染和封片
3． 实验结果
4． 讨论
第二节 pORFmIL-12阳离子冻干针剂治疗小鼠肺癌的药效学初步研究
1． 仪器与试药
2． 实验方法
2．1 荷瘤动物模型建立
2．2 给药
2．3 肿瘤大小测定与生存期计算
2．4 血清和组织样品的收集和检测
3． 实验结果
3．1 受试品对小鼠肿瘤生长的影响
3．2 荷瘤小鼠的生存期
3．3 肿瘤中mIL-12浓度
3．4 血清中mIL-12浓度
3．5 肺中mIL-12浓度
4． 讨论
第三节 阳离子LPD(pORFmIL-12)冻干针剂抑瘤机制研究
1． 仪器与试药
2． 实验方法
2．1 动物模型的建立和分组给药
2．2 NK、CTL效应细胞制备
2．3 NK、CTL靶细胞制备污~(51)Cr4小时释放试验
2．4 结果计算
3． 实验结果
3．1 NK细胞杀伤活性
3．2 特异性CTL杀伤活性
4． 讨论
第七章 肝细胞靶向脂质-聚阳离子-DNA复合物的研究
第一节 胆固醇半乳糖衍生物的合成
1． 仪器与试药
2． 合成路线
3． 合成方法
第二节 半乳糖化的质粒脂质纳米粒的肝细胞靶向性研究
1． 仪器与试药
2． 实验方法
2．1 Gal-LPD的制备
2．2 Gal-LPD的细胞转染试验
2．3 Gal-LPD的细胞毒性试验
3． 结果与讨论
3．1 配体分子结构对Gal-LPD转染率的影响
3．2 带不同电荷的Gal-LPD的转染率比较
3．3 转染后不同的孵育时间对转染率的影响
3．4 不同的转染剂量对转染率的影响
3．5 细胞毒性实验
4． 小结
结论
综述 肿瘤基因治疗的载体系统
1． 病毒载体系统
2． 非病毒载体系统
3． 结语
致谢
作者简介
声明
发布时间: 2005-11-09
参考文献
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