光滑球拟酵母中NADH代谢对其酵解途径的影响

论文摘要

本文以一株能在胞外大量积累丙酮酸的光滑球拟酵母（Torulopsis glabrata）四重维生素（硫胺素、生物素、吡哆醇和烟酸）的营养缺陷型菌株CCTCC M202019为研究菌株。通过:（1）添加氧化能力较强的底物葡萄糖酸钠;（2）过量表达形成水的NADH氧化酶氧化胞质中的NADH;（3）过量表达选择性氧化酶氧化线粒体内NADH等三种策略调控胞内NADH、NAD+浓度及NADH/NAD+比率,研究NADH浓度及形式对碳代谢流的流向及通量的影响。主要研究结果如下:1.好氧条件下T. glabrata能够利用葡萄糖酸钠为唯一碳源（3.5 g/L DCW）,在含有90g/L葡萄糖的培养基中于16 h添加10 g/L葡萄糖酸钠,与为添加葡萄糖酸钠的对照组相比,细胞生长、葡萄糖消耗速度、丙酮酸生产强度分别提高7.96%、13.04%和32.81%。其原因在于葡萄糖酸钠的添加,使胞内NAD+浓度提高了29.73%,NADH/NAD+比率和ATP含量分别下降26.89%和8.5% ;2.将来源于乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）中编码形成水的NADH氧化酶noxE基因过量表达于T. glabrata中,获得了一株NADH氧化酶活性为34.8 U/mg蛋白质的重组菌T. glabrata-PDnoxE。NADH氧化酶作用于细胞质中,将细胞质中NADH氧化为NAD+,同时生成水。与出发菌株T. glabrata相比,T. glabrata-PDnoxE发酵中NADH和ATP含量分别降低了18.1%和15.8%,而NAD+增加了11.1%,细胞浓度、葡萄糖消耗速度和丙酮酸生产强度分别提高了168%、44.9%和12%。发酵进行到36 h葡萄糖消耗完毕,补加50 g/L葡萄糖继续发酵20 h则使丙酮酸浓度提高到67.2 g/L;3.在T. glabrata中表达来源于荚膜胞浆菌（Histoplasma capsulatum）中编码选择性氧化酶的AOX1基因,获得一株选择性氧化酶活性为1.64 U/mg蛋白质的重组酵母T. glabrata-AOX1。选择性氧化酶存在于线粒体,在线粒体内将NADH直接氧化为NAD+,大大削弱细胞的呼吸作用。选择性氧化酶的表达,使胞内NAD+含量增加了69%,ATP含量降低了50.1%。在含有100 g/L葡萄糖的发酵培养基中,与出发菌株比较,细胞浓度降低了21.2%,葡萄糖消耗速度和丙酮酸浓度则分别增加了31.17%和38.1%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 概述
• 1.2 Torulopsis glabrata 发酵生产丙酮酸中的糖酵解速度
• +'>1.3 调控微生物细胞内NADH/NAD⁺
• 1.3.1 通过外源途径加速NADH 氧化再生
• 1.3.2 胞内NADH 再生的实现和调控
• 1.3.3 缺失竞争途径
• 1.3.4 引入外源代谢途径
• 1.4 本研究的主要内容
• 第二章 降低胞内NADH 加强光滑球拟酵母的丙酮酸生产速度
• 2.1 前言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 菌株
• 2.2.2 主要试剂和仪器
• 2.2.3 培养基
• 2.2.4 培养方法
• 2.2.5 葡萄糖、细胞浓度（DCW）测定
• 2.2.6 葡萄糖酸、有机酸测定
• +和ATP 测定'>2.2.7 NADH、NAD⁺和ATP 测定
• 2.3 结果
• 2.3.1 葡萄糖酸钠为唯一碳源对T. glabrata 生长和发酵生产丙酮酸的影响
• 2.3.2 葡萄糖酸钠为混合碳源时对T. glabrata 发酵生产丙酮酸的影响
• 2.3.3 不同葡萄糖酸钠添加时间对丙酮酸发酵影响
• 2.3.4 添加葡萄糖酸钠对T. glabrata 发酵NADH 代谢的影响
• 2.4 讨论
• 第三章 表达NADH 氧化酶对光滑球拟酵母NADH 代谢影响
• 3.1 前言
• 3.2 材料
• 3.2.1 菌株和质粒
• 3.2.2 主要试剂
• 3.3.3 主要仪器
• 3.3.4 培养基
• 3.2.5 发酵培养方法
• 3.3 方法
• 3.3.1 DNA 操作
• 3.3.2 PCR 扩增目的基因
• 3.3.3 尿嘧啶缺陷型菌株的构建
• 3.3.4 表达质粒pYX212-noxE 的构建
• 3.3.5 酵母电击转化及筛选
• 3.3.6 SDS-PAGE 分析
• 3.3.7 参数测定
• +的提取和测定'>3.3.8 ATP/NADH/NAD⁺的提取和测定
• 3.4 结果
• 3.4.1 尿嘧啶缺陷型菌株的构建
• 3.4.2 乳酸乳球菌noxE 基因的扩增和表达质粒的构建
• 3.4.3 重组菌的构建
• 3.4.4 过量表达NADH 氧化酶改善重组菌好氧生长性能及加速丙酮酸生产
• 3.4.5 过量表达NADH 氧化酶对NADH 代谢的影响
• 3.5 讨论
• 第四章 表达选择性氧化酶对光滑球拟酵母NADH 代谢的影响
• 4.1 前言
• 4.2 材料
• 4.2.1 菌株和质粒
• 4.2.2 主要试剂
• 4.2.3 主要仪器
• 4.2.4 培养基
• 4.2.5 发酵培养方法
• 4.3 方法
• 4.3.1 质粒p416-TEF 的提取
• 4.3.2 目的片段的PCR 验证
• 4.3.3 菌株T. glabrata-AOX1 的构建
• 4.3.4 T. glabrata-AOX1 中质粒的提取
• 4.3.5 T. glabrata-AOX1 的菌落PCR
• 4.3.6 参数测定
• +的提取和测定'>4.3.7 ATP/NADH/NAD⁺的提取和测定
• 4.4 结果
• 4.4.1 质粒p416-TEF 的提取及AOX1 基因片段验证
• 4.4.2 表达AOX1 的T. glabrata 重组菌构建
• 4.4.3 重组菌的质粒提取和菌落PCR 验证
• 4.4.4 表达选择性氧化酶对T. glabrata 发酵生产丙酮酸的影响
• 4.4.5 过量表达选择性氧化酶对NADH 代谢的影响
• 4.5 讨论
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文