甘蓝型油菜MPK4抗菌核病功能研究

论文摘要

核盘菌（Sclertinia sclerotiorum （Lib.）de Bary）引起的菌核病是油菜的一种最主要的病害,在中国和世界其他地方导致巨大的经济损失,至今未培育出高抗油菜品种,尚未找到有效的高抗材料。尽管化学农药的使用对菌核病具有一定的限制作用,但因农药残留以及缺乏及时准确的预测预报方法使得化学农药防效不高。目前,在重要的经济作物上已尝试采用基因工程来防治病害,然而,因为对菌核病的植物防卫分子机制尚不清楚,所以限制了利用基因工程方法来培育抗菌核病的油菜品种。研究已表明,植物MAPKs （mitogen-activated protein kinases）在植物防卫中起作用,可能是病害防卫反应信号传导链中一种新的成分。本研究克隆鉴定了一个编码甘蓝型油菜（Brassica napus）MPK4（BnMPK4）的基因,并将该基因转入油菜,研究了转基因植株的抗病性及相关的分子机制。首先克隆了BnMPK4的cDNA。DNAMAN软件分析发现这个cDNA的最终开放阅读编码框架编码373个氨基酸;BnMPK4与拟南芥、烟草、水稻和玉米的MPK4同源性分别为95%、85%、82%和81%,含有一个保守的氨基酸基序T201E202Y203,在其C-terminal extension含有一个共同的锚定区域CD domain。MAPK序列比对表明,BnMPK4属于TEY亚型B组。用抗病信号分子甲基茉莉酸（MeJA）、水杨酸（SA）类似物苯丙噻重氮（BTH）或核盘菌致病因子草酸等化学物质分别处理油菜品种中双9号,采用荧光定量PCR方法测定BnMPK4在各种化学物质诱导后的表达量,结果表明,BTH和草酸快速诱导该基因上调表达,而MeJA抑制其表达。对两个菌核病抗性不同的油菜品种接种S. sclerotiorum后,实时定量PCR实验结果显示,当核盘菌侵染6 h时,BnMPK4的转录水平在抗病品种中双9号中显著升高,在感病品种84039中下调表达;防卫素基因PDF1.2的表达也出现类似的现象,在抗病品种中上调,在感病品种中下调。为了进一步研究BnMPK4的抗菌核病功能,构建了植物表达载体pG4A-BnMPK4,并且转化油菜品种84039。除草剂（Bar）筛选、PCR、Southern blotting和Northern blotting检测后,选择5棵过表达BnMPK4油菜转基因植株作进一步研究。离体接种和活体接种抗病鉴定实验表明,转基因植株明显增强菌核病抗性;病斑发展logistic分析显示,转基因植株对核盘菌抗性增强是由于侵染延迟和病斑扩展慢造成的;Trypan blue组织染色实验调查显示,BnMPK4的过表达抑制了核盘菌的生长。相对于非转基因植株,转基因植株也提高了对灰霉病菌Botrytis cinerea的抗性。为了研究BnMPK4转基因植株的抗菌核病机理,采用定量RT-PCR调查转基因植株中植物防卫标记基因的表达变化。结果显示,当BnMPK4高表达时,PDF1.2（茉莉酸途径的标记基因）的表达水平显著提高,而PR-1（水杨酸途径的标记基因）下调表达。DAB（3,3-diaminobenzidine）组织染色实验表明,BnMPK4的过表达降低H2O2积累。外源H2O2处理转基因植株导致增强对菌核病和灰霉病的敏感性。这些结果表明MPK4正调控JA介导的防卫反应。本文提出BnMPK4和JA介导的防卫反应在油菜抗菌核病中具有重要的作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 植物防卫反应机制
• 1.1.2 R 基因介导的抗性—基因对基因抗性
• 1.1.3 过敏反应
• 1.1.4 活性氧类
• 1.1.5 依赖水杨酸（SA）的信号转导
• 1.1.6 依赖于茉莉酸/乙烯（JA/ET）的信号转导途径
• 1.2 防卫反应的复杂性
• 1.2.1 SA 和JA/ET 信号转导的相互作用
• 1.2.2 防卫反应对病原菌侵染进行灵活调节
• 1.3 油菜菌核病研究进展
• 1.3.1 菌核病菌的生物学特性
• 1.3.2 核盘菌的致病机理
• 1.3.3 油菜对菌核病抗病机制及抗病研究进展
• 1.4 油菜功能基因组研究进展
• 1.4.1 油菜基因组和功能基因组的研究
• 1.4.2 油菜与拟南芥重要功能基因的比较基因组学研究
• 1.4.3 油菜抗菌核病分子机制研究进展
• 1.5 MAPKs 在植物防卫中的作用
• 1.5.1 植物体中MAPK 的分类
• 1.5.2 MAPK 在植物体中的防卫功能
• 1.6 本课题研究的目的和意义
• 第二章 甘蓝型油菜MPK4 cDNA 的克隆及序列分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 甘蓝型油菜（Brassica napus）MPK4 cDNA 的克隆
• 2.1.2 大肠杆菌的转化
• 2.1.3 BnMPK4 cDNA 的测序
• 2.1.4 序列分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 BnMPK4 cDNA 核苷酸序列分析
• 2.2.2 BnMPK4 cDNA 氨基酸序列分析
• 2.2.3 进化分析
• 2.3 讨论
• 第三章 甘蓝型油菜 MPK4 诱导表达分析
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 植株培养
• 3.1.2 化学诱导处理
• 3.1.3 菌核培养
• 3.1.4 核盘菌接种
• 3.1.5 取样
• 3.1.6 总RNA 的提取
• 3.1.7 cDNA 制备
• 3.1.8 实时定量PCR
• 3.1.9 数据处理方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 苯丙噻重氮、甲基茉莉酸和草酸诱导BnMPK4 表达的动态变化
• 3.2.2 核盘菌侵染后BnMPK4 分别在抗、感病品种的表达变化
• 3.3 讨论
• 第四章 BnMPK4 在油菜中的过表达
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 植物表达载体pG4A 的构建
• 4.1.2 植物转化载体的构建
• 4.1.3 油菜的遗传转化
• 4.1.4 转基因油菜的PCR 检测
• 4.1.5 转基因油菜的Southern blot 鉴定
• 4.1.6 转基因油菜的Northern blot 表达鉴定
• 4.2 结果
• 4.2.1 植物表达载体的构建及阳性菌株的筛选和鉴定
• 4.2.2 油菜的转化和除草剂抗性苗的获得
• 4.2.3 转基因油菜PCR 检测
• 4.2.4 转基因油菜Southern blotting 检测
• 4.2.5 Northern blot 检测转基因植株BnMPK4 表达
• 4.2.6 转基因植株表现植株增大表型
• 4.3 讨论
• 第五章 BnMPK4 转基因油菜抗菌核病鉴定
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 转基因油菜T0 代植株菌核病接种
• 5.1.2 转基因油菜T1 代植株菌核病接种
• 5.1.3 菌丝生长观察
• 5.1.4 转基因油菜T1 代植株灰霉病接种
• 5.1.5 防卫基因的表达
• 2O₂ 积累的组织化学染色检测'>5.1.6 H₂O₂积累的组织化学染色检测
• 2O₂ 处理及菌核病和灰霉病接种'>5.1.7 植株H₂O₂处理及菌核病和灰霉病接种
• 5.2 结果
• 5.2.1 转基因油菜T0 代植株抗菌核病鉴定
• 5.2.2 转基因油菜T1 代植株抗菌核病鉴定
• 5.2.3 BnMPK4 过表达抑制核盘菌的生长
• 5.2.4 转基因油菜植株抗灰霉病鉴定
• 5.2.5 BnMPK4 高水平的表达激活PDF1.2 但是抑制PR-1 的表达
• 2O₂ 的积累'>5.2.6 过表达BnMPK4 降低H₂O₂的积累
• 5.3 讨论
• 第六章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历