我国2型猪链球菌致肝素结合蛋白释放机制的研究

论文摘要

猪链球菌（Streptococcus suis, SS）是重要的人畜共患病病原菌,共有35种血清型,其中SS2型是分布最广,毒力最强的血清型。SS能导致人的败血症、中毒性休克、脑膜炎、关节炎、心内膜炎以及眼内炎和永久性失聪等症状。我国分别于1998年和2005年在江苏和四川先后暴发流行SS2型感染疾病,两次爆发共导致多人死亡。这两次SS感染的死亡病例大多表现为链球菌中毒性休克综合征（streptococcal toxic shock like syndrome, STSS）,这在国外尚未出现,在国内也鲜有报道。目前对中毒性休克综合征（toxic shock like syndrome, TSS）的报道主要集中于金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）,而关于STSS的报道则主要集中于A族链球菌（group A Streptococcus, GAS）,对SS中毒性休克综合征的致病机制少之又少。前期研究中比较了我国8位SS2感染脑膜炎患者、6位SS2感染STSS患者、14位健康成年人血清中肝素结合蛋白（heparin-bind ing protein, HBP）水平,发现我国SS2感染的STSS患者血清中HBP含量明显高于脑膜炎患者及健康人,提示血液中HBP浓度升高可能是导致STSS发生的直接原因。基于这一发现,本实验室对SS2中HBP刺激因子进行了筛选,并初步确定该刺激因子为猪链球菌溶血素（suilysin, SLY）。本文在此基础上对SLY是HBP刺激因子做了进一步验证并对HBP释放的分子机制进行了探索。主要研究结果如下：1验证HBP释放刺激因子是SLY采用饱和（NH4）2SO4沉淀和阴离子层析、疏水层析相结合的方案,从SS2的培养物中分离得到天然SLY。同时,采用分子生物学方法获得重组SLY。采用Western blot方法,以抗（重组）SLY的多克隆抗体分析表明,SLY基因敲除株（△SLY）中不表达SLY。在此基础上,比较了天然SLY、重组SLY以及SS2野生株05ZYH33和敲除株ASLY培养上清刺激人全血以及全血中分离得到的中性粒细胞（polymorphonuclear nuetrophil, PMN）释放HBP的能力。结果表明,当天然和重组SLY的浓度为1μg/mL时,刺激人全血和PMN释放HBP比例能达到储存总量的30%以上；相对于05ZYH33较强的刺激HBP释放能力,△SLY培养上清刺激HBP释放的能力几乎完全丧失。这些结果表明,SLY是HBP释放的刺激因子。2探索HBP释放方式SLY高于一定浓度时对PMN有严重的裂解作用,会造成PMN死亡,但通过检测PMN活力指标——超氧阴离子（superoxide anion）释放的情况,发现PMN在1μg/mL天然SLY的作用下细胞活力并没有受到明显影响,这表明HBP的释放是在PMN保持生理活性的情况下进行的。为了验证HBP的释放是否是通过脱颗粒的方式进行,以流式细胞仪（flow cytometer）检测PMN表面目标CD抗原分子（CDllb, CD66b, CD63）的表达情况,结果显示,3种目标CD抗原分子中的2种（CD66b及CD63）在细胞表面表达量升高。进一步,用扫描电子显微镜（scanning electron microscopy）观察细胞表面起泡情况,结果显示,在经过天然SLY的刺激后PMN表面出现大量小泡样突起,这种小泡样突起是胞内蛋白颗粒融合到细胞膜上的表现。综合这些结果,证实HBP的释放是经过PMN脱颗粒方式进行的。3探索HBP释放信号通路PMN的脱颗粒作用涉及多种信号通路,为了探索HBP的释放是通过何种通路,用多种不同的信号通路特异性抑制剂分别对HBP的释放进行抑制,结果显示磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K）通路的特异性抑制剂以及p38-丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinases, p38 MAPK）通路特异性抑制剂有显著效果；一种小分子物质白三烯B4（Leukotriene B4, LTB4）在经天然SLY刺激后释放量增加,并且其受体—白三烯B4受体1（LTB4-BLT1）特异性抑制剂对HBP的释放有显著抑制作用。综合这些结果,认为HBP释放相关的信号通路为PI3K和p38MAPK,与HBP释放相关的受体为LTB4-BLT1。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 第一章 文献综述
• 1 猪链球菌
• 2 中毒性休克综合征与链球菌中毒性休克综合征
• 3 中性粒细胞
• 4 肝素结合蛋白
• 4.1 HBP功能
• 4.1.1 抗菌功能
• 4.1.2 趋化功能
• 4.1.3 导致血管通透性增加
• 4.2 HBP释放机制
• 4.2.1 化脓链球菌M蛋白刺激HBP的释放
• 4.2.2 链球菌溶血素O刺激HBP的释放
• 4.2.3 白细胞释放的小分子物质白三烯B4导致HBP的释放
• 4.2.4 A族链球菌引起的丹毒症状刺激HBP的释放
• 4.3 HBP的应用
• 4.3.1 HBP在感染病人中预测休克中的应用
• 4.3.2 HBP在预测循环衰竭中的应用
• 4.3.3 HBP在重症监护病房中的应用
• 4.3.4 HBP在诊断严重细菌性脑膜炎中的应用
• 4.3.5 HBP在诊断儿童尿道感染中的应用
• 4.3.6 HBP在其它方面的应用
• 5 研究目的和意义
• 第二章 SLY刺激HBP释放的验证
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要材料
• 1.1.2 主要溶液
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 天然SLY蛋白纯化
• 1.2.2 重组SLY蛋白纯化
• 1.2.3 抗SLY多克隆抗体纯化
• 1.2.4 Western blot检测SLY基因敲除株中SLY的表达情况
• 1.2.5 PMN分离
• 1.2.6 Western blot检测HBP
• 2 实验结果
• 2.1 野生株05ZYH33导致HBP释放的验证
• 2.2 天然与重组SLY蛋白及其多克隆抗体的纯化
• 2.3 SLY基因敲除后SLY蛋白表达情况验证
• 2.4 HBP的刺激释放
• 3 小结与讨论
• 3.1 小结
• 3.2 讨论
• 第三章 HBP释放方式的探索
• 1 材料与方法
• 1.1 主要材料
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 主要溶液
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 细胞稳定性检测
• 1.2.2 流式细胞仪检测PMN脱颗粒情况
• 1.2.3 扫描电镜观察PMN脱颗粒情况
• 2 实验结果
• 2.1 P353V刺激HBP的释放
• 2.2 细胞稳定性检测
• 2.3 流式细胞仪检测PMN脱颗粒
• 2.4 扫描电子显微镜观察PMN脱颗粒
• 3 小结与讨论
• 3.1 小结
• 3.2 讨论
• 第四章 HBP释放信号通路探索
• 1 材料与方法
• 1.1 主要材料
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 主要溶液
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 ELISA检测HBP
• 2 实验结果
• 2.1 抑制剂抑制HBP释放效果初筛
• 2.2 抑制剂抑制效果验证
• 3 小结与讨论
• 3.1 小结
• 3.2 讨论
• 第五章 结论与展望
• 1 结论
• 1.1 SS2中HBP刺激因子是SLY
• 1.2 HBP释放方式是通过脱颗粒作用
• 1.3 HBP释放信号通路为PI3K及p38MAPK
• 2 展望
• 参考文献
• 致谢