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WSSV的感染、高效检测及生物信息学分析

2020-12-03阅读(684)

WSSV的感染、高效检测及生物信息学分析

论文摘要

对虾白斑综合征的病原为一种无包埋体的类杆状病毒,此病毒被命名为白斑综合征病毒（White spot syndrome virus,WSSV）。该病感染率和致死率都极高,而且宿主域广泛,给养虾业造成了巨大的经济损失。本研究首先利用患WSSV的克氏螯虾的病料,通过回感健康螯虾,建立了稳定的白斑综合征病毒回感体系;并根据公布的WSSV的基因组序列（GenBank登录号为AF332093）设计引物,通过PCR扩增出其中的一个未知基因序列WSSV ORF 332,序列分析结果显示,该序列与GenBank中WSSV基因库中相应序列同源性达到98%,确认为克氏螯虾WSSV的基因片段;另外通过PCR方法检测了罗氏沼虾的WSSV,结果表明罗氏沼虾也是WSSV的天然宿主;将罗氏沼虾WSSV ORF 234克隆后,在原核系统中进行了表达,以SDS-PAGE及WesternBlot检测表达产物,结果显示ORF 234可以正确表达为蛋白质,而在克氏螯虾WSSV中也能扩增出与罗氏沼虾WSSV ORF 234相似的特异性条带。由于WSSV危害极大,宿主域广泛,准确而灵敏地诊断WSSV对于养殖生产有着积极的意义。本研究通过对WSSV基因组中的两个ORF区域进行了序列分析,分别设计了二套用于LAMP特异性扩增的引物,研究结果显示,该二套引物均能准确扩增出预期条带,温度是影响扩增结果的重要因素。其中对ORF 234片段扩增,LAMP的灵敏度比PCR扩增要高出近万倍,且不具有假阳性,扩增可以在1.5 h内完成,具时间省、灵敏度高、无假阳性、所需设备简单等优点,具有很好的推广应用前景。本研究还选取了部分WSSV基因片段,进行密码子的偏爱性分析,结果显示:这几个序列的密码子适应指数（CAI）偏低,同义密码子最佳密码子系数（FOP）接近0.4,密码子偏爱指数（CBI）多数为负值,说明这些区域的最佳密码子数目少于期望值,提示该病毒密码子偏爱性低,这或许是该病毒宿主域广的原因之一。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 文献综述
  • 第一节 WSSV 研究进展及概况
  • 1. WSSV 的命名与分类
  • 1.1. WSSV 的命名
  • 1.2. WSSV 的分类
  • 2. WSSV 的基因组和形态结构
  • 2.1. WSSV 的基因组
  • 2.2. WSSV 的形态结构
  • 3. WSSV 引起的典型症状和病理变化
  • 3.1 典型症状
  • 3.2 病理变化
  • 4. WSSV 传播途径及宿主
  • 4.1 传播途径
  • 4.2. WSSV 的宿主发展
  • 5. WSSV 病毒病的预防措施
  • 6. WSSV 主要检测与诊断技术
  • 第二节 环介导等温扩增技术
  • 1. 环介导等温扩增技术的技术特征
  • 1.1.L AMP 技术原理
  • 1.2.L AMP 的特点
  • 1.3 扩增原理
  • 2. LAMP 在病原体检测方面的应用
  • 参考文献
  • 第二章 一般实验材料与方法
  • 1. 实验材料
  • 1.1 生物材料
  • 1.2 工具酶及试剂盒
  • 1.3 其他试剂
  • 1.4 主要实验试剂与配制
  • 2. 实验常用仪器设备
  • 3. 常用方法
  • 3.1 基因组DNA 提取
  • 3.2 碱裂解法制备质粒
  • 3.3 感受态细胞的制备
  • 3.4 重组DNA 的转化
  • 3.5 连接反应
  • 3.6 琼脂糖凝胶电泳
  • 3.7 SDS-PAGE 蛋白质电泳
  • 参考文献
  • 第三章 WSSV 对克氏螯虾的感染与检测
  • 摘要
  • 1. 试验材料及方法
  • 1.1 试验材料
  • 1.2 试验方法
  • 1.3 引物设计
  • 1.4 PCR 检测WSSV
  • 1.5 LAMP 检测WSSV
  • 2. 结果
  • 2.1 螯虾感染病毒后症状
  • 2.2 电镜结果
  • 2.3 PCR 检测结果
  • 2.4 LAMP 检测结果
  • 2.5 LAMP 与PCR 检测结果比较
  • 3. 讨论
  • 参考文献
  • 第四章 用PCR 检测罗氏沼虾WSSV 及其ORF 234 表达
  • 摘要
  • 1. 材料和方法
  • 1.1 实验材料
  • 1.2 实验方法
  • 2. 结果与分析
  • 2.1 pET-28a（+）-WSSV ORF 234 质粒鉴定
  • 2.2 WSSV ORF 234 的核酸序列分析
  • 2.3 生物信息学分析
  • 2.4 表达产物的SDS-PAGE 和Western Blot
  • 3. 讨论
  • 参考文献
  • 第五章 WSSV 密码子偏爱性分析
  • 摘要
  • 1. WSSV ORF 332 的扩增
  • 1.1 实验材料与方法
  • 1.2 结果与分析
  • 2. 密码子偏爱性分析
  • 2.1 基因序列
  • 2.2 分析软件方法
  • 2.3 分析密码子使用频率采用的指标
  • 2.4 结果与分析
  • 3. 讨论
  • 参考文献
  • 主要结论与创新点
  • 攻读学位期间本人出版或公开发表的论著、论文
  • 附录1：缩略词表
  • 附录2 LAMP 引物设计图
  • 致谢

    • 相关论文文献

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