六味地黄丸对实验性肝癌自杀基因治疗增效作用的病理学研究

论文摘要

恶性肿瘤是严重危害人类健康和生命的重大疾病,原发性肝癌是常见的恶性肿瘤之一,尽管肿瘤的诊断和治疗水平不断提高,每年恶性肿瘤死亡率仍居高不下。肿瘤自杀基因治疗作为肿瘤治疗的一种新措施展现了良好的应用前景。但单纯自杀基因治疗时,虽然能够直接杀伤转染细胞并通过旁观者效应引起对未转染细胞的杀伤,但仍有部分肿瘤细胞残余导致肿瘤复发,这是该疗法存在的重大缺陷。由于免疫机制是旁观者效应产生的重要机制,改善自杀基因疗法作用的炎症免疫微环境是自杀基因疗法增效的主要途径,鉴于以往的研究表明六味地黄丸有增强机体免疫功能和直接抗肿瘤作用,因此本研究应用自杀基因疗法联合六味地黄丸对荷瘤小鼠进行治疗,观察其疗效并进行病理学研究。 目的:本实验旨在以往研究的基础上,将tk基因导入H22细胞,应用HSV-tk/GCV系统进行小鼠肝癌自杀基因治疗的体内实验,并联合运用中药六味地黄丸,观察联合治疗的疗效,并运用病理学技术及免疫组化等技术初步探讨其机制,为建立中西医结合肿瘤基因治疗方案提供必要条件。 方法:在已建立能稳定产病毒的PT67/tk细胞株的基础上,用NIH 3T3测定病毒滴度。将此病毒感染小鼠肝癌细胞株H22,G418筛选出抗性克隆命名为H22/tk。并将H22细胞与H22/tk细胞以4∶1的比例接种昆明种小鼠,建立移植瘤模型进行体内实验,应用前药GCV及灌服六味地黄丸,16日后处死测肿瘤质量,通过病理切片观察组织的病理变化,应用免疫组化技术观察肿瘤细胞PCNA及FasL的表达,应用TUNEL技术观察肿瘤组织中的细胞凋亡情况。 结果:重新筛选G418的稳定抗性克隆PT67/tk,扩大培养,测重组逆转录病毒液的病毒滴度为2×105cfu/mL。以逆转录病毒作为载体,成功将HSV-tk基因导入H22;通过形态学观察到H22/tk显示出对GCV的高敏感性。在体内实验中,HSV-tk/GCV自杀基因系统联合六味地黄丸治疗较单独应用HSV-tk/GCV系统相比,更显著地抑制了肿瘤生长,肿瘤质量相比有统计学意义。病理学及免疫组化研究发现联合组与六味地黄丸治疗组均能明显抑制肿瘤细胞的增殖,而单纯自杀基因治疗无此作用,在促进肿瘤细胞凋亡方面,联合组明显优于其他各组。 结论:体外实验证实GCV能明显杀伤H22/tk细胞,表明自杀基因已成功转入肿瘤细胞,为体内自杀基因疗法的研究奠定了基础;体内实验中,自杀基因系统联合六味地黄丸治疗显示出明显的协同抗肿瘤效应;六味地黄丸增效作用的机制与抑制肿瘤细胞的增殖和促进肿瘤细胞的凋亡密切相关;联合组肿瘤细胞凋亡的增多与肿瘤细胞FasL表达的减少可能有相关性,此相关性可能与FasL减少引起的瘤周免疫微环境的改善有关,尚需进一步研究。实验证实六味地黄丸对自杀基因疗法具有增效作用,通

论文目录

• 引言
• 第一部分 文献探讨
• 一、自杀基因治疗肝癌的研究进展
• 1 自杀基因治疗系统
• 2 旁观者效应
• 3 靶向调控
• 4 联合治疗
• 二、中医学对肿瘤的认识
• 1 溯源
• 2 病因病机
• 3 治法
• 三、六味地黄丸的研究进展
• 1 源流
• 2 相关现代药理研究
• 第二部分 实验研究
• 一、小鼠肝癌H22细胞的转染及体外杀伤
• 1 材料
• 2 各种试剂的配制
• 3 方法
• 4 结果
• 5 讨论
• 二、HSV-tk/GCV系统联合六味地黄丸治疗荷瘤小鼠的体内实验及病理定量分析
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 三、联合治疗对荷瘤小鼠肿瘤生长抑制的细胞增殖机制
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 三、联合治疗对荷瘤小鼠肿瘤生长抑制的凋亡机制
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第三部分 结语
• 参考文献
• 附录
• 致谢