传染性法氏囊病毒粒子感染及其A节段编码基因转化细胞的转录本初步分析

论文摘要

传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus，IBDV）侵染鸡法氏囊组织的B淋巴母细胞，导致严重的免疫抑制。为了探索IBDV感染及其编码基因转化对宿主细胞代谢的影响，本论文以Vero细胞为模型，利用LongSAGE技术（Long serial analysis of gene expression，LongSAGE），对IBDV感染、A节段、VP2／4／3、VP5基因转染的Vero细胞进行基因表达差异分析，从不同角度挖掘病毒感染过程中，细胞基因表达的调控网络关系，寻找病毒感染与细胞抗病毒过程中重要的基因及其相关通路。（一）传染性法氏囊病病毒A节段cDNA克隆以传染性法氏囊病病毒NB株（弱毒株）基因组dsRNA为模板，采用LA-PCR一步法扩增并克隆了IBDV基因组A节段全长cDNA。序列测定结果表明，IBDV基因组A节段全长共3，259个核苷酸，包括5’、3’-端的非编码区（NCR）和两个部分重叠的开放阅读框（ORF1和ORF2），与GenBank中IBDV其他毒株同源性为81.8-99.9％，与JD1、Cu-1、P2、CEF94等毒株的关系最近，而与欧洲、香港、日本的超强毒株和美国的变异株相对较远。其中ORF1编码1012个氨基酸的多聚蛋白（VP2／4／3）与JD1同源性高达99.5％，VP2片段与JD1，CEF94和D78同源性为99.8％，VP3片段与JD1同源性99.2％，VP4片段与JD1同源性100％，VP5片段与JD1、HZ2、P2、CEF94、CT、Cu-1和D78同源性99.3％。（二）表达IBDV编码基因的Vero克隆化细胞系构建将IBDV A节段、VP2／4／3、VP5、VP2、VP3等基因片段分别克隆入真核表达载体pEGFP-C2和pCI-neo，构建了pEGFP-VP5、pEGFP-pVP2系列、pCI-neo-A、pCI-neo-VP2／4／3、pCI-neo-VP5、pCI-neo-VP3、pCI-neo-pVP2系列等21种真核表达质粒，在Lipofectamine 2000介导下转染Vero细胞，利用荧光显微镜进行蛋白表达分析，结果显示：pEGFP-VP5转染Vero细胞后4-5h，能在细胞膜周围观察到与EGFP融合表达的VP5蛋白；pEGFP-pVP2系列蛋白在转染后9-12h开始出现绿色荧光细胞。在此基础上运用非融合表达的pCI-neo重组真核表达质粒转染Vero细胞，在G418抗性筛选下，进行表达IBDV A、VP2／4／3、VP5、VP2、VP3细胞的克隆，通过PCR／Southern blot、RT-PCR／Northern blot、IFA／IPMA等鉴定，获得了以下克隆化细胞系：获得了2株A节段可稳定表达其编码蛋白VP2、VP4、VP3和VP5蛋白的克隆化细胞系；获得了3株能稳定表达VP2、VP4、VP3的含VP2／4／3基因克隆化Vero细胞；获得了7株能稳定表达IBDV VP5蛋白的克隆化细胞；获得了17株能持续性表达不同VP2截短蛋白的克隆化细胞系；获得了3株稳定表达VP3蛋白的克隆化细胞系。（三） LongSAGE文库构建及数据分析应用LongSAGE技术，分别从IBDV感染的Vero细胞、Vero-A+9C4细胞、Vero-VP2／4／3+4G8细胞、Vero-VP5+2F11细胞及正常Vero细胞中抽提mRNA，建立了5个LongSAGE文库。验证转化效率与转化子大小后，各文库随机选取2000个插入片段大于500bp的转化子进行DNA测序分析。共获得代表24475（占总标签数的25.44％）种不同转录本的96213个随机标签，3124种转录本能与在人类染色体上找到相应位置（定位率为12.76％）。其中，从IBDV感染的Vero细胞库中获得代表9187种不同转录本的22193个标签；从正常Vero细胞库中获得代表8369种不同转录本的17663个标签；从Vero-VP5细胞库中获得代表7130种不同转录本的14221个标签；从Vero-A细胞库中获得代表10160种不同转录本的22968个标签；从Vero-VP2／4／3细胞库中获得代表8840种不同转录本的19168个标签。库间转录本表达差异分析显示：与正常的细胞相比较（P＜0.05），IBDV感染的细胞出现37种转录本表达上调、84种转录本表达下调，Vero-A细胞出现40种转录本表达上调、104种转录本表达下调，Vero-VP2／4／3细胞出现43种转录本表达上调、74种转录本表达下调，Vero-VP5细胞出现36种转录本表达上调、18种转录本表达下调。与IBDV感染细胞相比（P＜0.05），Vero-A细胞（335种转录本）、Vero-VP2／4／3细胞（334种转录本）、Vero-VP5细胞（91种转录本）出现显著水平的表达差异。与Vero-A细胞相比较，Vero-VP2／4／3细胞（49种转录本）、Vero-VP5细胞（113种转录本）出现表达水平的显著差异。与Vero-VP2／4／3细胞相比较，Vero-VP5细胞（104种转录本）均出现表达水平的显著差异。染色体定位结果显示：在23条人类染色体上，共有3124个注释基因获得定位。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一部分 文献综述
• 第一章 传染性法氏囊病病毒研究现状
• 1 IBDV发现历史
• 2 病毒学分类地位
• 3 基因组结构及编码蛋白功能
• 3.1 5’-NCR和3’-NCR
• 3.2 VP1蛋白
• 3.3 pVP2、VP2与4条多肽
• 3.4 VP3蛋白
• 3.5 VP4蛋白
• 3.6 VP5蛋白
• 4 病毒复制及分子机制
• 4.1 IBDV的宿主细胞
• 4.2 病毒复制的分子机制
• 5 IBDV致病机理与细胞凋亡
• 6 抗原与毒力变异
• 7 拯救技术在IBDV的研究中的应用
• 8 小结
• 第二章 基因表达系列分析及相关技术研究进展
• 1 SAGE技术的原理
• 2 SAGE文库构建方法的改进
• 3 SAGE标签的注释
• 3.1 注释策略
• 3.2 未注释标签的进一步分析
• 4 SAGE文库之间差异比较
• 5 SAGE获得的表达差异基因的进一步实验分析
• 5.1 Northern杂交分析
• 5.2 半定量RT-PCR和实时定量RT-PCR
• 5.3 基因芯片
• 6.SAGE-like技术
• 6.1 3’SAGE和5’SAGE
• 6.2 CAGE
• 6.3 GIS
• 6.4 SAGE与ChiP联用
• 6.5 DK和MSDK
• 6.6 DACS
• 6.7 其他
• 7 SAGE及相关技术的应用
• 7.1 转录组研究
• 7.2 基因表达差异研究
• 7.3 发现新基因
• 8 结束语
• 第二部分 研究内容
• 第一章 传染性法氏囊病病毒NB株基因组A节段全长CDNA克隆
• 1 材料和方法
• 1.1 载体、菌株、病毒株与SPF种蛋
• 1.2 病毒的增殖、纯化与电镜观察
• 1.3 IBDV基因组dsRNA的提取
• 1.4 引物设计和合成
• 1.5 Long accurate（LA）-PCR扩增基因组A节段全长cDNA
• 1.6 IBDV基因组A节段全长cDNA的T-A克隆
• 1.7 序列测定及分析
• 2 结果
• 2.1 病毒粒子观察与病毒基因组dsRNA提取
• 2.2 IBDV基因组A节段的克隆与鉴定
• 2.3 序列测定结果
• 2.4 序列分析
• 3 讨论
• 3.1 一步法LA-PCR克隆IBDV基因组A节段全长cDNA方法的建立
• 3.2 VP5蛋白
• 3.3 多聚蛋白（VP2/4/3）
• 3.4 关于IBDV抗原变异和毒力变异的分子基础
• 3.5 关于NB株与其它毒株的亲缘关系
• 第二章 传染性法氏囊病毒感染前后VERO细胞基因表达差异分析
• 1 材料和方法
• 1.1 细胞培养与病毒感染
• 1.2 细胞总RNA与mRNA分离
• 1.3 ds cDNA合成
• 1.4 NlaⅢ酶切双链cDNA
• 1.5 Linker与结合在磁珠上的cDNA连接
• 1.6 MmeⅠ酶切获得cDNA标记物
• 1.7 获得130-bp双标签
• 1.8 双标签分离
• 1.9 串联体产生
• 1.10 串联子pZErO-1载体克隆
• 1.11 Screening of Clones
• 1.12 序列测定与LongSAGE数据分析
• 2 结果
• 2.1 IBDV感染检测及细胞mRNA的分离
• 2.2 LongSAGE文库的构建及校验
• 2.3 测序结果及数据分析
• 3 讨论
• 3.1 选用LongSAGE技术依据及其文库构建
• 3.2 利用人类cDNA、UniGene数据注释标签
• 3.3 IBDV感染细胞基因表达谱特征
• 第三章 传染性法氏囊病病毒A节段或VP2/4/3基因转化的VERO细胞基因表达差异分析
• 1 材料和方法
• 1.1 抗体与试剂
• 1.2 真核表达载体构建
• 1.3 细胞培养、质粒转染及单细胞克隆
• 1.4 克隆化细胞的PCR和Southern blot鉴定
• 1.5 RT-PCR和Northern blot检测
• 1.6 A节段编码蛋白在克隆化细胞中的表达
• 1.7 DNA裂解分析和Caspase-3活性分析
• 1.8 Vero-A和Vero-VP2/4/3细胞LongSAGE文库构建
• 1.9 文库标签提取与库间差异分析
• 2 结果
• 2.1 真核表达载体构建
• 2.2 G418阳性细胞筛选与克隆
• 2.3 转入基因在克隆化细胞基因组中的整合分析
• 2.4 转入基因在克隆化细胞中的转录分析
• 2.5 转入基因表达产物在克隆化细胞中检测
• 2.6 DNA裂解分析和Caspase-3活性分析
• 2.7 Vero-A和Vero-VP2/4/3细胞LongSAGE文库构建
• 2.8 测序结果及数据分析
• 3 讨论
• 3.1 细胞系的建立
• 3.2 VP2和VP5蛋白表达与细胞凋亡
• 3.3 A节段NCRs的功能
• 第四章 表达传染性法氏囊病毒VP5蛋白的VERO细胞系建立及其转录本分析
• 1 材料与方法
• 1.1 pCI-neo-VP5和pEGFP-VP5质粒构建
• 1.2 Vero细胞培养、质粒转染及克隆
• 1.3 单克隆细胞株PCR和Southern blot鉴定
• 1.4 单克隆细胞株RT-PCR和Northern blot鉴定
• 1.5 IPMA和IFA检测VP5蛋白表达
• 1.6 VP5蛋白表达免疫胶体金定位
• 1.7 Vero-VP5细胞LongSAGE文库构建
• 1.8 文库标签提取与文库差异分析
• 2.结果
• 2.1 VP5真核表达载体的构建
• 2.2 克隆化细胞系的建立
• 2.3 VP5基因在克隆化细胞基因组中的整合分析
• 2.4 VP5基因在克隆化细胞中转录分析
• 2.5 VP5蛋白在Vero细胞中的表达
• 2.6 VP5蛋白在Vero细胞中的表达定位
• 2.7 Vero-VP5细胞LongSAGE文库的构建
• 2.8 测序结果及初步数据分析
• 3 讨论
• 3.1 细胞系的建立
• 3.2 VP5蛋白功能
• 第五章 表达传染性法氏囊病毒PVP2及其截短突变体蛋白的VERO细胞系的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 构建IBDV VP2系列真核表达载体
• 1.2 Vero细胞培养及质粒转染和单细胞克隆
• 1.3 单克隆细胞株PCR和Southern blot分析
• 1.4 RT-PCR和Northern blot检测
• 1.5 IPAM和IFA检测VP2蛋白表达
• 2 结果
• 2.1 IBDV VP2系列重组质粒的构建
• 2.2 G418抗性细胞筛选与克隆
• 2.3 VP2基因在克隆化Vero细胞基因组中的整合分析
• 2.4 克隆化细胞系中IBDV VP2基因mRNA转录检测
• 2.5 Vero细胞中VP2蛋白表达
• 3 讨论
• 第六章 表达传染性法氏囊病毒VP3蛋白的VERO细胞系的建立
• 1 材料和方法
• 1.1 pCI-neo-VP3真核表达载体的构建
• 1.2 Vero细胞培养及质粒的转染和单细胞克隆
• 1.3 单克隆细胞株的PCR和Southern blot鉴定
• 1.4 RT-PCR和Northern blot检测单克隆细胞株的mRNA转录
• 1.5 IPMA检测VP3蛋白表达
• 2 结果
• 2.1 真核表达载体构建
• 2.2 克隆化细胞系的建立
• 2.3 VP3基因在克隆化Vero细胞基因组中的整合分析与mRNA转录分析
• 2.4 VP3蛋白在Vero细胞中表达
• 3 讨论
• 全文总结
• 附表
• 参考文献
• 第三部分 附录
• 附录A 常用试剂及仪器
• 附录B 常用缓冲液及培养基配方
• 附录C 攻博期间发表或录用的学术论文
• 致谢