香蕉谷氨酸脱羧酶基因（MaGAD1）功能的初步研究

论文摘要

谷氨酸脱羧酶（Glutamate decarboxylase, GAD）广泛存在于动植物体内,是一种胞内酶,依赖磷酸吡哆醛辅酶催化L-谷氨酸生成γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric Acid,简称GABA）。GABA是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经传达物质,约50%的中枢神经突触部位以GABA为递质（Lee eta1.2001）,但在植物中GABA的作用还有待进一步的研究。编码GAD蛋白的基因也已经在很多植物中被克隆比如拟南芥（Bouche et al.,2004; Turano and Fang1998）、水稻(Akama et al.,2001；-Ohs et al.,2005、豇豆（Johanson et al.,1997）、番茄（Gallego et al.,1995）、烟草（Yuns and Ohs 1998）等。序列分析表明GAD蛋白含有两个保守结构域,一个是位于中间区域的5′-磷酸吡哆醛结合位点,另一个是在植物中特有的位于碳末端与钙调蛋白（CaM）结合的区域（Baum et al.,1993; Arazi et al.,1995; Gallego et al.,1995）. GAD酶的活性在生物体内受到pH值和Ca2+/CaM的调节。植物应对一些生物和非生物胁迫（如机械损伤、冷害、盐胁迫、植物激素、组织缺氧）时,GAD基因会呈现表达差异,GAD酶的活性也会相应改变,随之GABA会在植物各组织中迅速富集,从而在植物生理过程如PH值调控,三羧酸循环中碳的流通,氮的代谢、运输和储藏,植物防御起到一定的作用（Yunlong Zhuang et al.,2010; Juan et al.,2010; Bouche and Fromm 2004; Shelp et al.,1999; Alan WB et al.,1997; Pedro PG et al.,1995）。本实验室在前期获得了该基因的全长序列（MaGAD1）,组织特异性表达结果表明该基因在香蕉的根、茎、叶、花、果实中均有表达,其中果实中的表达量最高。采后荧光定量PCR结果显示,MaGADl在采后果实由绿转黄即乙烯跃变开始时相对表达量急剧上升到最大值约为采后早期的30倍,到乙烯峰值时其相对表达量略微下降,随后快速下降到最低值。这一结果推测MaGADl可能参与了香蕉果实采后乙烯生物合成过程。本研究为了了解香蕉MaGAD1是否参与各种非生物胁迫反应?是否参与乙烯生物代谢途径及如何调控?首先用外源乙烯利、水淹、伤害及低温处理,采用实时荧光定量PCR分析基因表达变化。结果显示乙烯利处理香蕉幼苗后,该基因在叶片中的表达被强烈的诱导上调表达,这与之前在对香蕉果实采用乙烯处理的结果一致。而且处理后叶片MaGAD酶活性和GABA含量也稍有增加但不显著,显示乙烯可能在转录水平上调控MaGAD1。对香蕉幼苗实施水淹、伤害和低温胁迫,MaGAD1的表达量没有明显变化,但MaGAD酶活性与内源GABA含量却显著增强,推测MaGAD1可能主要与乙烯代谢相关,而与上述非生物胁迫关系不明显。胁迫后MaGAD酶活性与内源GABA含量的变化,可能是与GAD基因家族中其他成员相关。构建花叶病毒35S启动子驱动MaGAD1植物表达载体pC1302-GAD1,通过农杆菌介导的花序浸泡法将该载体转入拟南芥中使MaGAD1过量表达。通过T1代抗性筛选及PCR检测获得了21株MaGAD1阳性植株,T3代抗性筛选获得了11株纯合株系。经过southern blot检测后选取C-4、C-6进行MaGAD1在转基因拟南芥中功能研究。通过对转基因植株的表型观察发现,转基因株系C-4、C-6种子萌发时间在正常条件和外源ACC处理时比野生型提前,而且发芽速率远高于野生型。在用0.2‰的乙烯利处理各株系成年植株后,检测乙烯信号转导和生物合成途径相关基因的表达,结果表明MaGAD1能够增强拟南芥体内乙烯信号通路上游元件ETR1和ERS1对外源乙烯感受程度,提高拟南芥植株乙烯生物合成途径ACS4和AC02的表达。结果说明MaGAD1调控乙烯生物代谢途径关键基因的表达,从而促进了乙烯生物合成过程,影响植物成熟和衰老。

论文目录

• 摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 香蕉生产现状
• 1.1.1 香蕉生产的重要性
• 1.1.2 香蕉植株抗逆品种选育的需要
• 1.1.3 香蕉果实采后货架期和品质的重要性
• 1.2 影响香蕉生长的气候因素
• 1.2.1 冷害
• 1.2.2 涝害
• 1.2.3 伤害
• 1.3 乙烯代谢途径研究进展
• 1.3.1 植物生理与乙烯
• 1.3.2 乙烯的合成途径
• 1.3.3 乙烯的信号转导途径
• 1.4 植物谷氨酸脱羧酶（Glutamate decarboxylase,GAD）研究进展
• 1.4.1 植物GAD、γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyrate,GABA）简介
• 1.4.2 植物谷氨酸脱羧酶的生成和活性调控
• 1.4.3 GABA功能和作用机理
• 1.4.4 乙烯与GAD、GABA的相互调控关系
• 1.5 拟南芥乙烯代谢研究进展
• 1.5.1 拟南芥模式植物的优势
• 1.6 本研究的目的意义
• 1.7 技术路线
• 2 材料、试剂与仪器
• 2.1 材料
• 2.2 试剂
• 2.3 仪器
• 3 方法
• 3.1 在非生物胁迫下香蕉幼苗中MaGAD1的表达
• 3.1.1 乙烯利处理香蕉幼苗
• 3.1.2 香蕉幼苗涝害胁迫
• 3.1.3 香蕉幼苗伤害胁迫
• 3.1.4 香蕉幼苗冷害胁迫
• 3.1.5 各胁迫处理后香蕉幼苗RNA提取
• 3.1.6 cDNA第一链合成
• 3.1.7 荧光定量RT-PCR分析MaGAD1在mRNA水平上的表达
• 3.1.8 荧光定量PCR的定量方法
• 3.2 香蕉叶片内GAD酶活性分析
• 3.2.1 工作曲线建立
• 3.2.2 MaGAD酶粗酶液的提取与酶反应
• 3.2.3 内源GABA提取
• 3.2.4 GABA定量测定
• 3.3 转MaGAD1基因拟南芥
• 3.3.1 拟南芥的培养
• 3.3.2 农杆菌介导的浸染花序法遗传转化拟南芥（Clough S J,Bent A F 1998）
• 3.3.3 T1带抗性筛选
• 3.3.4 转基因拟南芥T2代培养
• 3.4 MaGAD1转基因拟南芥的分子检测
• 3.4.1 野生型和MaGADl转基因拟南芥叶片总DNA提取
• 3.4.2 MaGAD1转基因拟南芥的PCR检测
• 3.4.3 MaGAD1转基因拟南芥的Southern blot检测
• 3.5 MaGAD1转基因植株种子萌发率及外源ACC处理对萌发率的影响及形态观察
• 3.6 MaGAD1转基因植株中乙烯相关基因的表达分析
• 3.6.1 外源乙烯利处理野生型和MaGAD1转基因植株
• 3.6.2 野生型和MaGADl转基因拟南芥叶片总RNA提取
• 3.6.3 cDNA第一链的合成
• 3.6.4 荧光定量PCR分析外源乙烯利处理下各株系中MaGAD1以及乙烯相关基因在mRNA水平上的表达
• 4 结果
• 4.1 非生物胁迫下MaGAD1在香蕉幼苗中的表达
• 4.1.1 外源乙烯利处理下MaGAD1基因在香蕉幼苗叶片中的表达
• 4.1.2 涝害胁迫下MaGAD1在香蕉幼苗叶片中的表达
• 4.1.3 伤害胁迫下MaGAD1在香蕉幼苗叶片中的表达
• 4.1.4 冷害胁迫下MaGAD1在香蕉幼苗叶片中的表达
• 4.2 工作曲线的建立
• 4.3 GAD酶在各胁迫下的活性变化
• 4.3.1 外源乙烯利处理下香蕉幼苗叶片中GAD酶的活性
• 4.3.2 涝害胁迫处理下香蕉幼苗叶片中GAD酶的活性
• 4.3.3 伤害胁迫处理下香蕉幼苗叶片中GAD酶的活性
• 4.4 各胁迫处理下香蕉叶片中内源GABA含量
• 4.4.1 外源乙烯利处理下香蕉幼苗叶片中内源GABA的含量
• 4.4.2 涝害胁迫处理下香蕉幼苗叶片中内源GABA的含量
• 4.4.3 伤害胁迫处理下香蕉幼苗叶片中内源GABA的含量
• 4.5 MaGAD1在拟南芥中过量表达
• 4.5.1 T1、T2代抗性筛选
• 4.5.2 MaG4D1转基因株系的PCR检测
• 4.5.3 MaGAD1转基因株系的Southern检测
• 4.5.4 MaGAD1转基因植株种子萌发率
• 4.5.5 外源ACC处理对MaGAD1转基因植株幼苗表型的影响
• 4.5.6 乙烯利处理下各株系中乙烯信号途径和生物合成相关基因在mRNA水平上的表达
• 5 分析
• 5.1 在香蕉幼苗中MaGAD1对各胁迫的应答分析
• 5.1.1 在各胁迫下MaGAD1表达量
• 5.1.2 各胁迫下GAD酶活性、内源GABA含量
• 5.2 野生型和转基因拟南芥种子萌发率
• 5.3 外源ACC处理野生型和转基因拟南芥的表型差异
• 5.4 MaGAD1转基因拟南芥中乙烯相关基因的表达分析
• 6 结论
• 参考文献
• 致谢