加味丹参饮诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的研究

论文摘要

目的：探讨加味丹参饮（Jia Wei Dan Shen Yin JWDSY）在体外能否诱导骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells BMSCs）向心肌样细胞分化,以及JWDSY对BMSCs移植心肌梗死心血瘀阻型大鼠心肌的作用。方法：实验一：采用全骨髓贴壁法培养大鼠BMSCs,并进行传代、扩增,对细胞形态学和生长特性进行观察,通过流式细胞术对细胞表面抗原CD90、CD11b、CD45进行表型鉴定。采用水提醇沉法制备JWDSY的提取物并通过MTT法检测不同浓度JWDSY提取物对BMSCs的毒性作用及增殖的影响。实验二：体外诱导BMSCs,将培养的BMSCs分为4组：正常对照组、5-Aza组、JWDSY组和JWDSY+5-Aza组进行诱导分化。通过免疫组化的方法检测心肌细胞特有的结蛋白Desmin、肌球蛋白MHC和肌钙蛋白T的表达,用RT-PCR的方法检测心肌转录因子GATA-4 mRNA的表达。实验三：建立大鼠急性心梗心血瘀阻模型,正常组大鼠10只,60只造模成功大鼠分为4个组：模型组、JWDSY组、BMSCs组和JWDSY+BMSCs组。移植28d后,免疫组化双染法检测大鼠心肌组织中心肌结蛋白Desmin和肌球蛋白重链MHC的表达,Masson三色染色法检测大鼠心肌组织心室肌瘢痕面积百分比和心肌血管新生情况,RT-PCR法检测大鼠心肌组织中心肌细胞转录因子GATA-4 mRNA的表达。结果：实验一：经流式细胞术鉴定通过全骨髓贴壁法培养的BMSCs纯度较高,细胞表面抗原CD90阳性细胞达到95%以上,CD11b和CD45阳性细胞小于5%,符合实验要求。MTT结果显示,0.625mg/mL的JWDSY为进行BMSCs诱导的工作浓度。实验二：体外对BMSCs进行诱导后,正常对照组中未发现MHC、Desmin知CTnT阳性细胞；JWDSY组、5-Aza组和JWDSY+5-Aza组免疫组化染色均可见阳性免疫复合物。经JWDSY+5-Aza联合诱导后的BMSCs其MHC表达量高于JWDSY组和5-Aza组,差异有统计学意义（P<0.05）,JWDSY组与5-Aza组两组间差异无统计学意义（P>0.05）。经JWDSY+5-Aza联合诱导后的BMSCs其Desmin表达量高于JWDSY组和5-Aza组,差异有统计学意义（P<0.05）,JWDSY组与5-Aza组两组间差异无统计学意义（P>0.05）。经JWDSY+5-Aza联合诱导后的BMSCs其CTnT表达量高于JWDSY组和5-Aza组,差异有统计学意义（P<0.05）,JWDSY组与5-Aza组两组间差异无统计学意义（P>0.05）。JWDSY+5-Aza组、JWDSY组和5-Aza组GATA-4 mRNA相对光密度值与正常对照组比较差异具有统计学意义（P<0.05）。实验三：移植后28d,Masson染色切片结果显示,正常组未见梗死灶和纤维形成,其余各组均出现大小不等的梗死灶,JWDSY组+BMSCs组、JWDSY组和BMSCs组的心室肌瘢痕面积百分比均较模型组显著减小（P<0.01）；JWDSY组+BMSCs组较JWDSY组和BMSCs组瘢痕面积百分比显著减小（P<0.05）,JWDSY组和BMSCs组两者之间比较,无显著差异（P>0.05）。与正常组比较,各造模组的心肌毛细血管数均增高,差异有统计学意义（P<0.05）。JWDSY组、BMSCs组和JWDSY+BMSCs组的心肌毛细血管数较模型组显著增加（P<0.01）；JWDSY+BMSCs组与JWDSY组和BMSCs组比较,心肌毛细血管数增加有显著性意义（P<0.05）,JWDSY组和BMSCs组两者之间比较,差异无显著性意义（P>0.05）。在模型组和JWDSY组梗死边缘未见有MHC-Brdu、Desmin-Brdu双染表达；BMSCs组和JWDSY+BMSCs组均可见猩红色Brdu抗体着色和棕色MHC蛋白的同时表达以及猩红色Brdu抗体着色和棕色Desmin蛋白的同时表达。JWDSY+BMSCs组的阳性细胞计数高于BMSCs组（P<0.05）。RT-PCR检测GATA-4 mRNA的表达结果显示,正常组和模型组未见到阳性条带,JWDSY组阳性条带较弱,BMSCs组和JWDSY+BMSCs组可见阳性条带,对其IOD值半定量分析JWDSY+BMSCs组高于BMSCs组（P<0.05）。结论：（1）JWDSY在体外能促进BMSCs向心肌样细胞分化,并可以加强5-Aza诱导BMSCs向心肌样细胞分化的作用。（2）在心梗心血瘀阻证大鼠模型中JWDSY组、BMSCs组和JWDSY+BMSCs均能促进新生血管,增加移植细胞的血供,能缩小梗死面积。而JWDSY能促进BMSCs移植后的血管新生和减少瘢痕形成。（3）在心梗心血瘀阻证大鼠模型中JWDSY能促进移植的BMSCs向心肌样细胞分化,JWDSY与BMSCs移植联合应用的疗效较单用更佳。

论文目录

• 英文缩略词一览表
• 中文摘要
• Abstract
• 引言
• 第一部分 大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、扩增和鉴定
• 材料与方法
• 1.材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 试剂
• 1.3 主要试剂的配制
• 1.4 主要仪器
• 2.方法
• 2.1 BMSCs的分离与培养
• 2.2 细胞计数
• 2.3 BMSCs的传代及纯化
• 2.4 绘制BMSCs的生长曲线
• 2.5 BMSCs的鉴定
• 2.6 MTT法测定JWDSY对BMSCs的无毒剂量和工作剂量
• 2.7 统计学处理
• 结果与讨论
• 1.实验结果
• 1.1 大鼠BMSCs体外生长的形态学特征
• 3、P₄、P₅代BMSCs生长'>1.2 P₃、P₄、P₅代BMSCs生长
• 1.3 BMSCs表面抗原的鉴定
• 1.4 JWDSY对BMSCs的细胞毒性
• 2. 讨论
• 第二部分 JWDSY诱导大鼠BMSCs向心肌样细胞分化的实验研究
• 材料与方法
• 1.材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要试剂配制
• 1.4 主要仪器
• 2.方法
• 2.1 BMSCs的分离与培养
• 2.2 BMSCs的传代及纯化
• 2.3 BMSCs的鉴定
• 2.4 BMSCs细胞计数
• 2.5 BMSCs的分组
• 2.6 免疫细胞化学法检测CTnT、Desmin和MHC的表达
• 2.6.1 细胞爬片的制作
• 2.6.2 采用免疫细胞化学SP法染色
• 2.6.3 结果判断方法
• 2.7 RT-PCR检测心肌细胞转录因子GATA-4 mRNA的表达
• 2.7.1 细胞总RNA的提取
• 2.7.2 mRNA的反转录
• 2.7.3 反转录产物扩增
• 2.7.4 PCR产物电泳鉴定
• 2.8 统计学处理
• 结果与讨论
• 1.实验结果
• 1.1 BMSCs分离、培养及鉴定
• 1.2 免疫组织化学检测诱导后BMSCs的MHC、Desmin和CTnT的蛋白表达
• 1.3 RT-PCR检测诱导后的BMSCs心肌细胞转录因子GATA-4 mRNA结果
• 2.讨论
• 2.1 BMSCs体外诱导分化为心肌样细胞的研究
• 2.2 体外诱导心肌结蛋白eDsimn、肌球蛋白MHC和肌钙蛋白TcTn的变化
• 2.3 体外诱导心肌细胞转录因子GATA-4 mRNA的变化
• 3.结论
• 第三部分 JWDSY对BMSCs移植治疗心梗的作用
• 材料与方法
• 1.材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要试剂配制
• 1.4 主要仪器
• 2.方法
• 2.1 大鼠BMSCs的分离培养和扩增
• 2.2 大鼠BMSCs的标记
• 2.3 AMI心血瘀阻证模型制备
• 2.4 大鼠血液流变学检测
• 2.5 动物分组
• 2.6 灌胃
• 2.7 检测指标和方法
• 2.7.1 标本的取材及预处理
• 2.7.2 MHC和Desmin双染的检测
• 2.7.3 心脏组织的形态变化的检测
• 2.7.4 心肌细胞转录因子GATA-4mRNA的表达
• 2.8 统计学处理
• 结果与讨论
• 1.实验结果
• 1.1 大鼠一般情况资料
• 1.2 急性心肌梗死模型心电图改变
• 1.3 血液流变学指标结果
• 1.4 心脏组织的病理变化
• 1.5 大鼠心室肌瘢痕面积百分比
• 1.6 心肌血管新生
• 1.7 JWDSY对BMSCs移植后MHC-Brdu表达的影响
• 1.8 JWDSY对BMSCs移植后Desmin-Brdu表达的影响
• 1.9 JWDSY对BMSCs移植后GATA-4mRNA表达的影响
• 2. 讨论
• 2.1 心肌梗死模型的选择
• 2.2 BMSCs的标记
• 2.3 BMSCs移植治疗心梗大鼠的时机选择
• 2.4 BMSCs移植的途径
• 2.5 中医学对冠心病的认识
• 2.6 JWDSY的组方依据和前期研究
• 2.7 中医学对BMSCs治疗AMI的认识
• 2.8 JWDSY对BMSCs移植的影响
• 结论
• 全文总结
• 致谢
• 参考文献
• 附录一 文献综述
• 参考文献
• 附录二 发表论文和参与的科研项目