阴道毛滴虫物理图谱的初步绘制与其细菌人工染色体（BAC）文库构建条件的研究

论文摘要

阴道毛滴虫属单细胞寄生性原生动物，在分类上属肉鞭门鞭毛亚门的动鞭毛纲，毛滴虫目，毛滴虫科，毛滴虫属，人是它唯一的寄主。阴道毛滴虫引发的滴虫性阴道炎(trichomoniasis)是世界上最常见的性传播疾病(STD，sexually transmitted disease)之一。阴道毛滴虫的基因组约为160Mb，且至少65％为重复序列，为了完成其全基因组的测序和组装，绘制一张高精度的物理图谱尤为重要。本研究以阴道毛滴虫的EST数据、基因组WGS测序数据和Fosmid文库为基础，利用STSpooling的方法初步绘制了阴道毛滴虫的物理图谱。通过生物信息学的详细分析，实验在候选的STSs中共设计了1353对PCR引物，筛选了基因组Fosmid文库中46个superpools共17664个克隆，最后参与物理图谱拼接的有810个STSs和2555个克隆。拼接得到382个contigs和102个singlets，总长度为21.9Mb，基因组覆盖率约为12.5％。最长的congtig是由26个STSs定位在119个clones上得到的，长度约为410.2kb。由于阴道毛滴虫的基因组比项目开始时预期的20Mb左右要大出近8倍，因此用插入片断较小、基因组覆盖度低的Fosmid文库很难绘制高质量的物理图谱，进而我们尝试构建平均插入片段大于100kb的基因组BAC文库，并利用其构建高精度的物理图谱。通过对阴道毛滴虫基因组BAC文库构建试验研究，发现：阴道毛滴虫含有较多内源性核酸酶(nuclease)，为了避免其降解DNA，需在制备琼脂糖包埋块时加入浓度为1.5％的DEPC，才得较好的抑制核酸酶的活性。通过测验BamHⅠ，EcoRⅠ，HindⅢ和MboⅠ四种限制性内切酶对阴道毛滴虫基因组的酶切情况，发现MboⅠ的酶切位点较多，随机性比较好，适宜作为MboⅠ作为部分酶切的限制性内切酶。同时还对部分酶切的条件进行了研究，确定0.08U／plug MboⅠ，37℃，60min为最佳部分酶切条件。此外还研究了1.8Kv和2.1Kv两个条件下的电转化情况，发现高电压2.1Kv时更有利于小片断的转入；而低电压1.8Kv时更有利于大片断的转入，但转化效率较高电压有所降低。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 阴道毛滴虫（Trichomonas vaginalis）简介及其基因组研究进展
• 1.2 基因组常用测序策略
• 1.3 基因组物理图谱简介
• 1.4 人工染色体的研究及其应用
• 1.5 本研究的目的和意义
• 第二章 材料和方法
• 2.1 虫株
• 2.2 Fosmid 基因组文库
• 2.3 大肠杆菌菌株及 BAC 载体
• 2.4 主要药品和酶
• 2.5 常用试剂和培养基
• 2.6 物理图谱的绘制方法
• 2.7 BAC 文库构建方法
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 阴道毛滴虫物理图谱的初步绘制
• 3.2 阴道毛滴虫 BAC 文库构建条件的研究
• 第四章 总结和展望
• 4.1 总结
• 4.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录