论文摘要
本研究从海带中提取岩藻聚糖并进行分级纯化,通过肉鸡饲喂试验及细胞培养试验,系统地探讨了海带岩藻聚糖（FLJ）及其级分（Fraction）对肉鸡巨噬细胞免疫功能的调控作用,为研究开发海带岩藻聚糖作为饲料添加剂提供了理论依据。1、海带岩藻聚糖的提取和分级纯化经过正交试验获得了海带岩藻聚糖的最佳提取条件,分别为物料比1:25,浸提时间6h,浸提温度100℃。在此条件下,海带岩藻聚糖提取物的得率为16.21%,海带岩藻聚糖得率为5.47%。通过DEAE纤维柱和Sephacryl凝胶柱对海带岩藻聚糖进行分级纯化,得到5个级分,分子量分别为40KD、74KD、163KD、240KD、360KD,各级分中海带岩藻聚糖的纯度大于90%,通过薄层层析分析表明,各个级分均以岩藻糖为主,且含有比例不同的葡萄糖、木糖和鼠李糖,通过紫外光谱和红外光谱分析,表明5个级分均不含有蛋白质和核酸,而且具有多糖特有的振动峰。2、海带岩藻聚糖对肉鸡生产性能和免疫功能的影响试验采用单因子设计,将600只1日龄AA肉鸡随机分为4个处理组,每组设6个重复,分别为添加0（对照组）、100 mg/kg（低剂量组）、500 mg/kg（中剂量组）和1000mg/kg（高剂量组）的海带岩藻聚糖,测定肉鸡生产性能和免疫功能。研究结果显示,日粮中添加海带岩藻聚糖对肉鸡生产性能无显著影响,可提高42日龄肉鸡脾脏和胸腺指数,促进ConA诱导的T淋巴细胞转化,提高CD4+T淋巴细胞亚群比例,提高腹腔巨噬细胞iNOS活性和NO产生量,促进呼吸爆发。表明海带岩藻聚糖可提高肉鸡的免疫机能,同时提示肉鸡腹腔巨噬细胞和T淋巴细胞可能是海带岩藻聚糖发挥作用的靶细胞。3、海带岩藻聚糖及其级分对体外培养肉鸡巨噬细胞免疫功能的影响通过三个独立试验分别研究不同剂量海带岩藻聚糖及其级分对体外培养肉鸡巨噬细胞功能的影响。试验采用单因子设计,每个试验分为7个处理组,分别为岩藻聚糖组、5个级分组和空白对照组,每个处理组设8个重复。研究结果表明,中、高剂量海带岩藻聚糖对体外培养肉鸡巨噬细胞的免疫功能具有促进作用,能够提高巨噬细胞吞噬活性,促进巨噬细胞呼吸爆发、NO的产生量和iNOS的酶活,促进巨噬细胞分泌细胞因子IL-1;不同级分对肉鸡巨噬细胞免疫功能的调控作用不同,其中FractionⅢ和FractionⅣ的促进作用最强,而FractionⅤ仅在中剂量条件下提高了巨噬细胞NO和iNOS的活性,对其他免疫指标无显著作用。4、海带岩藻聚糖及其级分对氧化应激条件下巨噬细胞功能的影响试验采用单因子设计,分为8个处理组,分别为空白对照组、氧化损伤组、氧化损伤+岩藻聚糖组、氧化损伤+5个级分组,每个处理组设8个重复。本试验结果表明,tBOOH诱导肉鸡巨噬细胞氧化损伤,同时显著抑制巨噬细胞的免疫功能,此时添加海带岩藻聚糖及其级分可缓解巨噬细胞的氧化损伤,并提高巨噬细胞的免疫功能。海带岩藻聚糖不同级分的抗氧化活性不同,以FractionⅢ和FractionⅣ的作用最强,同时FractionⅢ和FractionⅣ对巨噬细胞免疫功能的促进作用也最强,由此表明,海带岩藻聚糖对巨噬细胞的免疫促进作用与其抗氧化活性有关。5、海带岩藻聚糖及其级分对肉鸡巨噬细胞钙信号传导的影响由两个单独的试验组成,采用单因子完全随机设计。第一个试验共设6个处理,分别为海带岩藻聚糖及其5个级分,测定细胞培养液中加入多糖后的钙信号变化。试验结果显示,海带岩藻聚糖及其级分影响肉鸡巨噬细胞胞内钙离子浓度,其中岩藻聚糖、FractionⅢ、FractionⅣ显著升高胞内钙离子浓度,FractionⅠ、FractionⅡ和FractionⅤ显著降低胞内钙离子浓度。第二个试验共设8个处理,分别为A23187组、EGTA组、岩藻聚糖、岩藻聚糖+EGTA、FractionⅢ、FractionⅢ+EGTA、FractionⅣ、FractionⅣ+EGTA,测定不同处理组的钙离子浓度和巨噬细胞存活率、吞噬活性、NO、iNOS、细胞因子等免疫指标。用A23187升高胞内钙离子浓度,巨噬细胞免疫功能加强,用EGTA螯合细胞外钙,巨噬细胞免疫功能降低,同时岩藻聚糖、FractionⅢ、FractionⅣ加入EGTA后,细胞钙离子浓度显著降低,巨噬细胞的吞噬功能、呼吸爆发、NO、iNOS、细胞因子IL-1均显著降低。结果表明,海带岩藻聚糖、FractionⅢ、FractionⅣ促进巨噬细胞免疫功能与其促进细胞钙离子浓度的升高有关。综合上述体内、体外试验结果,可以得出:海带岩藻聚糖可显著提高肉鸡腹腔巨噬细胞的吞噬活性、呼吸爆发、NO、iNOS活性和细胞因子的分泌,调节肉鸡的免疫功能。不同岩藻聚糖级分对肉鸡巨噬细胞免疫功能的促进作用不同,以FractionⅢ、Ⅳ的作用最为显著。海带岩藻聚糖及其级分对肉鸡巨噬细胞免疫功能的影响与其抗氧化能力和调节细胞内钙离子浓度有关。