新型rPA(K)原核载体的构建及其表达研究

论文摘要

本研究将rPA（K）（经突变去除PAI-1结合位点）eDNA克隆至原核表达载体pET-30a（+）中,构建了其新型原核表达体系,并对其优化表达、复性和纯化等条件进行了探索,以达到去除非目的片段、方便检测、利于纯化、节约成本的目的,从而为rPA（K）的规模化制各奠定了基础。实验结果如下: 一、利用PCR技术,获得了rPA（K）eDNA片段,将其克隆至pET-30a（+）载体,成功构建了新型rPA（K）原核表达载体pLrA（K）,实现了其初步表达。目的蛋白分子量约为43kD,与预期结果相一致。蛋白含量占菌体总蛋白的24.3%,蛋白平均密度为0.16。ELISA检测显示,表达产物与抗t-PA抗体呈特异性阳性反应,平均含量为210ng/mL。 二、运用均匀设计法对影响rPA（K）在大肠杆菌中表达的因素进行了优化,摸索出了最佳表达条件:当溶解氧为90%、IPTG终浓度为0.1mmol/L、IPTG诱导时间为5.3小时、培养基为HD、pH值为6.0、诱导温度为25℃时,rPA（K）的表达量最高,目的蛋白平均密度从0.16提高到0.48,比优化前提高了3倍。 三、采用不同的洗涤剂（脲、Triton X-100、乙醇）依次洗涤包涵体、并经硫酸铵沉淀,得到了纯度较高的包涵体。结果表明,经2M脲、0.1%Triton X-100、20%乙醇洗涤,15%硫酸铵沉淀后,包涵体的纯度由16.0%提高到56.6%。 四、采用稀释复性和透析复性两种方法对表达产物进行了复性,并比较了两种方法的复性效率。结果表明,采用透析复性法,rPA（K）的比活可达1.33×105IU/mg;采用稀释复性法,其比活可达1.06×103IU/mg。即透析复性的效率是稀释复性效率的1.25倍,因此前者的效果要好于后者。 五、利用S.TagTMrEK纯化试剂盒对目的产物进行了纯化,并对rEK和MgCl2两种洗脱剂的洗脱效果进行了比较。SDS-PAGE结果显示,以MgCl2洗脱后的产物,分子量未发生变化,仍为43kD;而以rEK洗脱后的产物,其纯度达到了72%,且分子量减小至约40kD,表明去除了融合蛋白中的非目的片段。

论文目录

• 第一章 引言
• 第二章 研究内容
• 实验一: 新型rRA（K）原核载体的构建及初步表达
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 4. 小结
• 实验二:运用均匀设计法优化rPA（K）在原核系统中的表达条件
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 4. 小结
• 实验三:rPA（K）原核表达产物的复性与纯化
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 4. 小结
• 第三章 结论
• 参考文献
• 致谢