GGPS的克隆及其对番茄的遗传转化

论文摘要

提高类胡萝卜素含量是番茄品质育种的三大重要目标之一。番茄红素是人体血浆和组织中重要的类胡萝卜素。有证据表明,经常通过膳食补充番茄红素,具有提高免疫力,预防多种癌症,保护心血管等保健功能。目前,植物体内类胡萝卜素代谢途径已经基本清楚,对番茄红素代谢过程中一些重要酶进行了定位、分离和克隆。GGPP（牦牛儿基牦牛儿基焦磷酸）是类胡萝卜素合成途径的起始点。类胡萝卜素的大量合成总是伴随着GGPS（牦牛儿基牦牛儿基焦磷酸合成酶）基因的高水平表达,GGPS是IPP（异戊烯焦磷酸）向GGPP转化的限速酶,其活性高低不仅影响类胡萝卜素合成,也影响类异戊二烯途径中其它产物的合成,因此研究GGPS基因的表达,对于进一步揭示番茄果实类胡萝卜素代谢机制具有重要意义。本研究拟以本课题组得到的GGPS基因片段与NCBI公布的GGPS基因（DQ267903）序列设计特异性引物,以两份番茄红素含量差异显著的材料:普通番茄（编号E6203）和源于多毛番茄的渐渗系（编号TA517）为试材,分别克隆其DNA、cDNA;并利用染色体步移技术,扩增其上游侧翼序列。以明确两种不同来源番茄的GGPS基因在番茄果实番茄红素积累的调控功能上的差异,为进一步揭示番茄类胡萝卜素代谢机制奠定基础。主要研究结果如下:1.克隆了普通番茄和来源于多毛番茄的GGPS基因。结合已知植物GGPS基因进行多序列对比和进化树构建发现,番茄GGPS基因与被定位于叶绿体中的植物聚在一起,表明本实验所得GGPS基因很可能定位于叶绿体中,为质体中类胡萝卜素等化合物的合成提供前体物质GGPP。通过对不同器官的半定量RT-PCR分析发现,果实与花器官中的GGPS基因表达量比较多,表明所得GGPS基因可能与果实有关。通过序列比较分析发现,来源于多毛番茄的GGPS基因与普通番茄GGPS基因之间,编码区内存在23处碱基差异,导致9个氨基酸残基所携带的R基性质发生了变化;蛋白二级结构以及磷酸化位点不一致,据此推测差异氨基酸残基可能会对GGPS蛋白功能特性有一定影响。2.利用改良的双链接头介导的染色体步移技术,获得了番茄GGPS基因上游侧翼序列,经PLACE和PLANTCARE数据库在线分析发现,所得序列中除TATA盒与CAAT盒等保守元件外,还存在大量其他转录调控序列,推测可能是有活性的启动子区。两个不同来源的GGPS基因侧翼序列中顺式元件的分布比较保守,但中间区段序列差异较大,值得进一步研究。3.将两个不同来源的GGPS基因分别与CaMV35S启动子和NOS终止子相连,构建了组成型表达载体,通过根癌农杆菌遗传转化,得到转基因苗,RT-PCR检测表明导入的GGPS基因能在番茄T0代表达。目前,转基因阳性苗已移入大田,进入正常栽培管理阶段。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 农杆菌介导的番茄遗传转化
• 1.1.1 农杆菌的研究历史
• 1.1.2 农杆菌介导的遗传转化的优点
• 1.1.3 农杆菌介导的遗传转化机理
• 1.1.4 影响农杆菌介导番茄遗传转化的因素
• 1.2 类胡萝卜素代谢及其相关基因
• 1.2.1 类胡萝卜素的性质和分布
• 1.2.2 类胡萝卜素的基本结构
• 1.2.3 类胡萝卜素的生理功能
• 1.2.4 类胡萝卜素的合成途径
• 1.2.5 主要酶及其基因分离
• 1.3 番茄果实品质分子改良研究进展
• 1.3.1 番茄果实品质性状遗传特性
• 1.3.2 番茄果实品质基因工程研究进展
• 1.4 本研究的目的和意义
• 1.5 技术路线
• 第二章 GGPS 基因克隆与序列分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株和试剂
• 2.1.3 方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 基因组DNA 及总RNA 的质量检测
• 2.2.2 GGPS 基因扩增结果
• 2.2.3 番茄GGPS 基因序列及其所推导氨基酸序列比较分析
• 2.2.4 番茄GGPS 基因上游侧翼序列分析
• 2.2.5 番茄GGPS 推导蛋白的功能分析
• 2.2.6 GGPS 基因在不同器官中的表达差异分析
• 2.3 讨论
• 第三章 农杆菌介导GGPS 基因转化番茄
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 表达载体构建
• 3.2.2 农杆菌工程菌株构建
• 3.2.3 番茄转化再生培养过程
• 3.2.4 转基因苗的检测
• 3.3 讨论
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介