DON诱导望水白cDNA文库构建与基因表达分析

论文摘要

由禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病是世界温暖潮湿和半潮湿地区广泛发生的一种严重性病害。该病发生后,不仅造成产量损失,而且病麦粒中含有多种危害人、畜健康的单端孢霉烯族毒素,其中脱氧血腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol,简称DON）危害最大,但是有关小麦抗DON遗传机制方面的研究报道较少。本研究以我国高抗赤霉病小麦品种望水白为试材,构建了DON诱导cDNA文库,并通过EST测序、半定量RT-PCR和染色体定位分析,旨在揭示DON诱导后小麦基因的表达特点,为小麦抗DON遗传育种研究提供新的信息。研究结果如下:选取抽穗后2d的望水白穗子,通过单花滴注接种DON(100mg.kg-1),分别提取诱导24 h和48 h的RNA等量混合后,使用SMART文库构建试剂盒构建了DON诱导穗组织λ噬菌体cDNA文库。滴度测定表明,初始文库滴度为3×106pfu/mL,重组率达95%,能够代表mRNA的复杂度,扩增后的文库滴度为2×109 pfu/mL;初始文库直接转入大肠杆菌BM25.8,经检测,其插入片段介于500～2000 bp,平均1053 bp。随机挑选96个克隆进行3′端测序,测序长度介于60-891 bp,平均393 bp。选取48条长度大于300 bp的EST在NCBI的GenBank中用BLAST软件进行比对后将其分成6类:（1）核糖体蛋白基因6条（13%）;（2）初级代谢与次生代谢相关基因8条（18%）;（3）DNA结合、RNA加工相关蛋白基因4条（9%）;（4）免疫或逆境相关蛋白基因5条（11%）;（5）未知功能基因9条（20%）;（6）未发现显著同源性的基因13条（29%）。根据这些序列,共设计17对新的小麦EST-PCR引物,并成功用于半定量RT-PCR扩增。以DON诱导0、6、12、24、48、72、96、120 h的望水白穗组织cDNA为模板,半定量分析发现,14个EST基因表现上调表达,1个基因表现下调表达,2个基因表达无差异。利用一套中国春缺体-四体进行染色体定位分析发现,clone1-1（具有SNF2结构域的蛋白基因）位于染色体7A,clone1-9（核糖体蛋白L9基因）位于2D,clone3-6（类金属硫蛋白基因）位于1A和1B。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 文献综述
• 1 小麦抗禾谷镰刀菌毒素（DON）研究进展
• 1.1 禾谷镰刀菌毒素研究
• 1.2 DON对小麦的毒害
• 1.3 DON在小麦赤霉病病程中的作用
• 1.4 小麦抗禾谷镰刀菌毒素研究
• 2.全长cDNA文库的构建与小麦EST研究
• 2.1 全长cDNA文库构建
• 2.2 小麦EST研究
• 第二部分 研究报告
• 一、材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.3 文库构建过程所需的培养基（见附录1）
• 1.4 总RNA的提取
• 1.5 cDNA文库的构建
• 1.6 质粒DNA的小量提取（碱裂解法）
• 1.7 插入片段大小检测
• 1.8 部分克隆的一端测序
• 1.9 引物设计和RT-PCR
• 1.10 EST的染色体定位
• 二、结果与分析
• 2.1 DON诱导望水白cDNA文库的构建及评价
• 22 随机克隆测序与EST分析
• 2.3 DON诱导表达基因的功能注释
• 2.4 DON诱导表达基因的表达分析
• 2.5 DON诱导表达基因的染色体定位
• 三、讨论
• 3.1 DON诱导望水白cDNA文库的构建及评价
• 3.2 DON处理后望水白穗组织的基因表达分析
• 全文结论
• 附录1
• 文库构建过程所需的培养基
• 质粒DNA（碱裂解法）提取液的配制
• 附录2:
• 测序的结果
• 参考文献
• 致谢