论文摘要
系膜细胞病理性增殖及系膜基质的增多是肾小球肾炎中最常见的病理改变，大多数肾小球肾炎具有慢性进行性发展的趋势，在进展过程中系膜细胞不仅是受害者，而且通过分泌炎症因子和细胞外基质主动参与肾小球炎症的发展，促进肾小球硬化。其中转化生长因子β1（TGF-β1）可刺激细胞外基质分泌，是重要的促纤维化因子之一，其活化后可刺激系膜细胞合成Ⅱ、Ⅳ型胶原，FN等细胞外基质的重要组成元素，增加系膜区系膜外基质的积聚，加速肾小球硬化的进展。而细胞凋亡在肾小球增殖性病变的形成和消散过程中也起着非常重要的作用。近年来研究显示，在某些自限性增殖性肾小球疾病中，增殖的肾小球系膜细胞可以通过细胞凋亡机制而自行缓解，使肾小球结构恢复正常。有关增殖性肾炎的治疗，目前首选的药物是肾上腺糖皮质激素，然而，有相当一部分病人对其产生依赖、抵抗，甚至出现严重副作用，随后，环磷酰胺、苯丁酸氮芥、环孢菌素A等免疫抑制剂的治疗应运而生，但仍有部分病人难以取得满意的疗效，开发新的药物也就成为当今研究的热点。中药单体蟾蜍灵来源于中华大蟾蜍和黑框蟾蜍耳后腺及皮肤腺分泌的浆液，分子式为C24 H34 O4，相对分子质量为386.5，研究表明这种成分具有抗癌、强心、毒性及麻醉等作用，有可能是通过干扰细胞周期而抑制白血病细胞的增殖，通过改变凋亡相关基因如bcl-2家族、异常活化MAPK等多种途径诱导肿瘤细胞分化和凋亡。我们推测蟾蜍灵对肾小球系膜细胞可能有类似的作用，但目前关于蟾蜍灵对肾小球系膜细胞的作用知之甚少，为此，本研究一方面观察蟾蜍灵对GMC的异常增殖及细胞外基质分泌的影响，另一方面观察蟾蜍灵对异常增殖的GMC凋亡的影响，为将其开发应用于临床增殖性肾小球肾炎治疗提供理论依据。第一部分蟾蜍灵对大鼠肾小球系膜细胞增殖和细胞外基质分泌的影响目的:探讨蟾蜍灵（bufalin）对脂多糖（LPS）诱导的大鼠肾小球系膜细胞（GMC）增殖及细胞外基质（ECM）分泌的影响。方法:体外培养大鼠肾小球系膜细胞，分为对照组、LPS刺激组（LPS 5mg/L）和蟾蜍灵干预组（LPS 5mg/L和Bufalin 1×10-8mol/L），应用台盼兰拒染法检测蟾蜍灵对GMC的细胞毒性作用,通过MTT、流式细胞技术检测GMC增殖变化，RT-PCR检测白细胞介素-6（IL-6）和转化生长因子-β1（TGF-β1）的mRNA的表达,ELISA法检测GMC培养上清中纤维连接蛋白（FN）及TGF-β1的表达。结果: MTT结果显示蟾蜍灵浓度在1×10-8mol/L及以上时呈剂量依赖性抑制GMC增殖（P<0.01）。细胞周期分析显示蟾蜍灵组S期细胞比例较脂多糖组降低（P<0.01）。蟾蜍灵干预组与脂多糖组相比IL-6和TGF-β1的mRNA相对表达量减少（P<0.01）,FN、TGF-β1蛋白分泌量减少（P<0.01）。结论:蟾蜍灵对LPS作用后肾小球系膜细胞增殖及细胞外基质分泌具有抑制作用。第二部分蟾蜍灵对脂多糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞凋亡的影响目的：探讨蟾蜍灵（bufalin）对脂多糖（lipopolysaccharides,LPS）诱导的大鼠肾小球系膜细胞（glomcrular mesa ngial cell,GMC）凋亡的影响。方法：体外培养大鼠肾小球系膜细胞，分为对照组、LPS刺激组和蟾蜍灵干预组，应用台盼兰拒染法检测蟾蜍灵对GMC的细胞毒性作用，应用透射电镜观察系膜细胞超微结构的变化，采用逆转录PCR检测Bax和bcl-2基因mRNA的表达，Western blot法检测Bax和bcl-2的蛋白表达。结果：透射电镜观察蟾蜍灵干预组可见凋亡早期形态学改变。逆转录PCR和Western blot结果显示蟾蜍灵组较脂多糖组Bax表达增多，bcl-2表达减少，差异均具有统计学意义（P<0.01），蟾蜍灵干预后，Bax较bcl-2表达过量。结论：蟾蜍灵可能通过调节Bax和bcl-2的相对表达量而诱导脂多糖作用后肾小球系膜细胞发生凋亡。