孕酮对人妊娠子宫平滑肌收缩功能及细胞内钙离子作用的研究

论文摘要

在大多数国家,早产是新生儿发病和死亡的主要原因。子宫平滑肌的过早兴奋可能会导致分娩发动的提前,而平滑肌细胞内的游离钙离子在平滑肌兴奋-收缩偶联中起着关键作用。如何控制子宫平滑肌的兴奋性是目前早产研究中亟待解决的问题。在妊娠和分娩中子宫平滑肌功能的调节是目前生殖科学领域研究的热点。虽然已经过几十年的研究,但该问题的复杂性依然存在,其主要原因是由于我们对此现象背后的重要的细胞和分子机制缺乏了解。子宫平滑肌和其他平滑肌不同,它在很大程度上受着激素的调控。其中孕酮是维持妊娠期子宫静息状态的主要激素。人们发现,人类妊娠晚期母体血孕酮的水平不像其他动物出现下降,而是持续升高,虽然目前比较公认的“功能性孕酮撤退”理论可以比较合理的解释妊娠妇女体内孕酮这种变化的特殊现象,但其根本的调节机制仍存在争论。近年来孕酮作用机制的研究主要集中在其经典的基因组机制和快速的非基因组机制这两方面。孕酮的基因组机制主要是由其核受体（nPRs）所介导的。而其非基因组机制的研究由于其快速而直接的特点近来逐渐成为人们关注的热点。但国内外目前在此方面的研究大多仍局限于动物实验,而对于人类妊娠子宫肌离体标本的研究虽然已有部分学者着手进行,但其取得的结果却错综复杂,无法形成确定的结论。因此,深入地研究孕酮对子宫肌兴奋与收缩的调节及其机制,可进一步地认识人类分娩启动和早产发生的机制,从而进一步为预防和治疗早产及其他子宫平滑肌异常收缩相关疾病提供理论依据。本实验希望通过对人妊娠子宫肌肌条等长张力的测定来初步研究孕酮对人妊娠子宫平滑肌收缩功能的调节,并进一步通过观察孕酮对子宫平滑肌细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)的影响来了解其调节子宫收缩的可能作用机制,从而进一步了解孕酮对妊娠及分娩发动的影响。方法:1、应用子宫平滑肌组织进行肌条等长张力测定:直接在已建立子宫肌条规律宫缩的浴槽中按浓度递进方式加入孕酮或单独应用孕酮联合其受体拮抗剂（RU486）,观察并记录肌条收缩情况。分为四组:A组:非催产素（OT）诱导的足月未临产（termnon-labor,TNL）组;B组:非OT诱导的足月临产（term labor,TL）组;C组:OT诱导的TNL组;D:OT诱导的TL组。每组均进行孕酮浓度效应实验和RU486作用实验。2、分离和培养人子宫平滑肌细胞:剖宫产手术中于胎儿娩出后取少量（1.0g左右）子宫下段平滑肌标本,用Ⅰ型胶原酶及DNA酶共同消化组织,并获得原代细胞,进行培养。获得细胞待进行激光扫描共聚焦显微镜（confocal）下测定细胞内[Ca2+]i的变化实验。3、运用激光扫描共聚焦显微镜（confocal）测定子宫平滑肌细胞内[Ca2+]i的变化:将原代培养的子宫平滑肌细胞用胰酶传代,分别进行如下实验:（1）孕酮浓度效应实验;（2）孕酮作用时间效应实验;（3）孕酮受体拮抗剂RU486作用实验。用共聚焦显微镜扫描（confocal）分析给药液前后细胞内游离钙荧光强度的变化。结果:1、子宫肌条等长张力测定结果:（1）孕酮对子宫肌条收缩波曲线下面积（AUC）的抑制率在四组（A、B、C、D）中总体呈现出一个随着孕酮浓度的增高而逐渐增加的趋势。◆在非OT诱导的TNL和TL组,不同浓度的孕酮对子宫肌收缩波AUC的抑制率与加药前相比均无统计学差异（P＞0.05）。◆在OT诱导的TNL和TL组,孕酮对子宫肌收缩波AUC的抑制率与加药前相比差异有统计学意义。TNL组中,当孕酮浓度达到10-6mol/L时统计学上出现差异（P＜0.05）;TL组中,当孕酮浓度为10-8mol/L时即已出现统计学差异（P＜0.05）,随着孕酮浓度的增高,其抑制更加明显（P＜0.01）。TL组与TNL组比较存在差异,其对TL组子宫肌收缩波AUC的抑制率较TNL组有所增高,差异有统计学意义（P＜0.05）。（2）联合应用孕酮(10-7mol/L)及其受体拮抗剂（RU486）(10-6mol/L),子宫肌条收缩波AUC的抑制率与用药前比较无统计学差异（P＞0.05）。2、细胞培养结果:联合使用胶原酶和DNA酶可获得活力较好的子宫平滑肌细胞,经鉴定纯度近100%。3、激光共聚焦扫描结果:（1） 10-8mol/L、10-7mol/L和10-6mol/L浓度的孕酮均可明显抑制催产素诱导的子宫平滑肌细胞内钙离子浓度的升高（P＜0.01）,且呈现浓度依赖性,随着孕酮作用浓度的增高,其抑制作用增强,其中10-8mol/L和其他浓度比较差异有统计学意义（P＜0.05）;（2）孕酮预处理3分钟、5分钟、7分钟和10分钟均能抑制催产素诱导的子宫平滑肌细胞内钙离子浓度的升高（P＜0.01）,且该效应存在着时间依赖性,随着孕酮作用时间的延长,其抑制作用增强,其中3分钟时间组和其他时间组比较差异有统计学意义（P＜0.05）;（3）联合应用孕酮及其受体拮抗剂RU486可以拮抗孕酮对催产素诱导的人妊娠子宫平滑肌细胞内钙离子浓度升高的抑制作用。而单独应用RU486对催产素诱导的子宫平滑肌细胞内钙离子浓度的升高并无明显抑制或增强作用（P＞0.05）。结论:1、孕酮对人妊娠子宫平滑肌条收缩功能呈现抑制作用,且表现出浓度依赖性。其抑制作用在OT诱导的子宫肌条收缩组中差异有统计学意义。孕酮对OT诱导的TL子宫肌收缩的抑制作用强于TNL子宫肌。孕酮的这一作用可以被其受体拮抗剂RU486所拮抗。2、孕酮对催产素诱导的人足月妊娠子宫肌细胞内钙离子浓度的升高的抑制作用较明显,人妊娠末期正常的生理浓度(10-7mol/L)甚至小于该生理浓度10倍(10-8mol/L)或更低浓度时即可表现出明显的抑制效应。孕酮抑制催产素诱导的子宫平滑肌细胞内钙离子浓度升高的效应存在着浓度依赖性和时间依赖性。孕酮的这一作用也可以被其受体拮抗剂RU486所拮抗。综上所述,孕酮作为维持子宫静息状态的主要激素之一在人类可以通过快速的非基因组作用机制对妊娠子宫肌的收缩发挥抑制作用,其抑制作用呈现浓度依赖性和时间依赖性,在临产子宫肌和未临产子宫肌中存在着差异。并且孕酮抑制子宫肌收缩的作用可以被其受体拮抗剂所拮抗。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 前言
• 第一部分 孕酮对人妊娠子宫平滑肌收缩功能的调节研究
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 孕酮对人妊娠子宫平滑肌细胞内钙离子浓度的影响
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 结论
• 文献综述
• 致谢