论文摘要
弓形虫是一种专性细胞内寄生的原虫，引起人兽共患的弓形虫病，可以通过肉食品感染人及动物。建立灵敏的、快速的、PCR检测方法是必须的。本实验进行了三方面的研究。1建立猪弓形虫Nested-PCR检测方法，弓形虫基因组SAG2基因片断设计并合成两对引物，建立快速、准确、灵敏的Nested-PCR检测猪弓形虫的方法。灵敏度试验结果可检测到每克肉102个弓形虫基因组DNA水平；对新孢子虫、隐孢子虫、柔嫩艾美耳球虫、猪肉孢子虫牛球虫、伊氏锥虫等种病原生物检测，结果均为阴性，表明此方法特异性强。将采自兽医院门诊及屠宰场的68份猪血清样品分别用Nested-PCR和PAPS进行平行检测。PAPS初步检测68份样品，阳性及可疑的血清样品共计17份，PCR检测出阳性样品16份。结论认为，巢式PCR方法可用于弓形虫早期感染的检测，具有敏感性高、特异性强、稳定性好的特点。2弓形虫上海株DNA为模板，采用PCR方法扩增SAG2基因，通过与pGEM T-Easy vector连接、转化JM109、克隆、测序，得上海株弓形虫SAG2基因序列与RH株高度相似。3 SAG2-pGEM T-Easy vector为模板，扩增编码主要表面抗原P22的基因片段。将该基因片段播入T／A克隆，引入酶切位点，双酶切、纯化目的片段与PGEX-6p-1按一定比例T4连接。用PCR结合双酶切的方法鉴定，核酸测序验证，将构建好的原核表达载体eP22—pGEX-6P-1转入表达菌株BL21中，用1mmol／L IPTG诱导表达，SDS-PAGE观察表达效果，Western-blot对融合蛋白进行鉴定。结果：成功的构建eP22—pGEX-6P-1质粒，转化宿主菌BL21诱导4hr后能高效的表达融合蛋白。