论文摘要
深海有机氮的降解是海洋生态系统氮循环的重要环节。在海洋中,生物合成的高分子量有机氮（High-Molecular-Weight Organic Nitrogen, HMWON）以颗粒有机氮（particulate organic nitrogen, PON）的形式,从海水表层,沉降到深海沉积物中。PON在微生物的作用下降解为高分子量的溶解有机氮（dissolved organic nitrogen, DON）, DON再经过微生物的分解、氨化、硝化和反硝化作用,最终完成整个氮循环。因此,深海沉积物中PON的降解在沉积物整个氮循环过程中具有非常关键的作用。深海沉积物中PON的主要成分是难以被降解的氨基化合物,如胶原蛋白和弹性蛋白等。胶原蛋白由于其特殊的三螺旋结构和复杂的聚合形式,其稳定性非常高,很难被除胶原蛋白酶以外的其他蛋白酶降解。目前,研究最多的胶原蛋白酶为哺乳动物的基质金属蛋白酶。细菌中胶原蛋白酶的报道则较少,且多来自陆地致病菌。由于对海洋胶原蛋白酶缺乏研究,因此海洋中胶原蛋白是如何被降解的还不清楚。研究深海胶原蛋白酶的作用机制对于最终阐明深海沉积物中氮的循环机制和开发新型蛋白酶具有重要的意义。适冷蛋白酶MCP-01是分离自深海沉积物中的适冷菌Pseudoalteromonas sp.SM9913分泌的主要蛋白酶。蛋白酶MCP-01前体由835个氨基酸残基组成,该酶属于丝氨酸蛋白酶S8家族subtilisin亚家族。Subtilisin中的蛋白酶成熟后绝大多数只含有一个催化结构域,但MCP-01的成熟酶包括催化结构域、连接区域、P结构域和PKD结构域四部分,是一个多结构域的subtilisin,此类型蛋白酶被我们命名为Deseasin。本论文以蛋白酶MCP-01对胶原蛋白的降解作用为研究对象,对MCP-01的生化性质、分子结构、催化机制及其应用基础进行了研究,取得了如下研究结果。1.MCP-01及其各结构域的异源表达体系的建立和分离纯化MCP-01是一个典型的适冷蛋白酶,由于其具有多个结构域,热稳定性较差,在中高温条件下容易发生自溶现象,常规的异源表达方法很难得到有活性的酶。建立适合MCP-01异源表达的条件对进一步研究酶的结构与功能显得尤为重要。我们的研究发现,MCP-01在大肠杆菌中的重组表达量较低。在成熟前MCP-01以不具有活性的酶原形式存在于重组菌内。在50%海水LB培养基中经15℃,200rpm诱导8天后MCP-01能够分泌到重组菌胞外,并具有活性,但表达分泌量较低,为19.6 U/ml。探索并优化了MCP-01催化结构域CD和C端PKD结构域在大肠杆菌中的表达和分离纯化条件。最终确定重组蛋白CD的最佳产酶条件为：在50%海水LB培养基中,37℃培养重组菌至OD600=2.0时添加0.05 mM IPTG,在15℃,200 rpm下诱导7天。从发酵液中利用阴离子交换层析和凝胶过滤层析分离纯化有活性的CD重组蛋白,产量为64.8 U/ml。PKD的最佳诱导条件为：在LB培养基中在37℃培养重组菌至OD600=1.2,添加0.5 mM IPTG,在15℃,200 rpm下诱导48 h。由于诱导表达的PKD存在于重组菌的胞内,利用超声波破碎和谷胱甘肽融合蛋白亲和层析法分离纯化含GST标签的PKD重组蛋白,再经凝血酶切割和谷胱甘肽亲和层析得到电泳纯的PKD。质谱分析表明,纯化后的CD和PKD重组蛋白的分子量与根据序列推算的分子量一致。以上结果为进一步研究酶的催化性质和机制奠定了基础。2.MCP-01催化胶原蛋白降解的底物特异性和酶学性质通过分析蛋白酶MCP-01对各种蛋白和合成肽类的降解效率,并与梭菌产的胶原蛋白酶的底物特异性进行比较,我们发现蛋白酶MCP-01能降解多种类型的胶原蛋白,特别是对海洋动物来源的胶原蛋白具有很强的降解能力。除了对不溶的Ⅰ型胶原蛋白有很强的降解效率之外,MCP-01对于多种可溶性胶原蛋白都能降解,降解效率为明胶>酸溶Ⅰ型胶原蛋白>Ⅳ型胶原蛋白>Ⅱ型胶原蛋白。为了分析MCP-01对胶原蛋白的降解机制,用蛋白酶MCP-01酶解牛Ⅰ型胶原蛋白,电泳分离酶解片段,通过N端测序分析了MCP-01在Ⅰ型胶原蛋白上的酶切位点。结果表明,MCP-01在牛Ⅰ型胶原蛋白上有多个特异性切点,这是首次阐明了一个细菌丝氨酸类胶原蛋白酶在胶原蛋白上的切点。其对胶原蛋白的降解方式与动物来源的典型胶原蛋白酶—基质金属蛋白酶（MMP）在胶原蛋白上的酶切方式完全不同。以不溶的Ⅰ型胶原蛋白为底物,我们研究了MCP-01的各种酶学性质。MCP-01在0℃下仍具有12.4%的胶原酶活,是目前唯一报道的适冷胶原蛋白酶。MCP-01在pH 9.0的Tris-HCl缓冲液中的活性最高,在pH 6.0-10.0缓冲体系中能保持60%以上的活性。Ca2+能够显著增强MCP-01的活力,而Zn2+、Ni2+、Cu2+和Fe2+显著抑制MCP-01酶活。3.MCP-01的C端PKD结构域对胶原蛋白的结合能力和膨胀机制MCP-01的C端具有一个功能未知的PKD结构域。PKD结构域约由80-90个氨基酸残基组成,最早在人体多囊性肾病致病蛋白中发现,随后陆续在一些微生物的几丁质酶、纤维素酶和少数蛋白酶中发现。目前,其结构已被结晶和解析,结果发现,尽管一级序列差异较大,但所有PKD都具有类似于抗体的β折叠结构。到目前为止,PKD结构域在蛋白酶中的功能一直没有得到阐明。我们研究发现,缺失PKD结构域的MCP-01的CD能够降解不溶的Ⅰ型胶原蛋白,但效率只有MCP-01全酶的60%左右。而用重组的PKD结构域预先处理胶原蛋白,可以明显提高MCP-01的CD对胶原蛋白的降解效率。这些结果表明MCP-01中的PKD结构域在酶催化胶原蛋白降解的过程中可能发挥重要作用。在大肠杆菌中将PKD结构域基因与绿色荧光蛋白基因融合表达和分离纯化,获得了电泳纯的融合蛋白PKD-EGFP。通过测定溶液中PKD-EGFP与胶原蛋白作用前后的荧光值,分析了PKD-EGFP与胶原蛋白的结合能力,结果表明PKD结构域对不可溶胶原蛋白具有很强的结合能力。为了分析PKD结构域中起作用的关键位点,首先通过序列比对分析了MCP-01的PKD结构域中的保守氨基酸残基,然后构建和表达了这些氨基酸残基的点突变体,并分析了突变体对胶原蛋白的结合能力。结果表明,PKD结构域中36位的色氨酸残基的突变使PKD结构域对胶原蛋白的结合能力几乎完全丧失。而且利用圆二色谱对突变体的结构分析表明,36位的色氨酸的突变没有对PKD结构域的结构产生影响。这些结果表明,36位的色氨酸残基是PKD结构域结合胶原蛋白过程中起关键作用的位点。进一步研究发现,PKD结构域能够导致胶原蛋白的膨胀,并且膨胀作用具有温度依赖性。通过SEM观察到PKD处理后的胶原蛋白直径由5.3μm增加到8.8μm。通过AFM观察到PKD结构域能够与胶原蛋白结合,导致胶原纤丝内部发生解离和松散。Zeta电位结果表明,胶原蛋白表面带有正净电荷,经PKD处理后,胶原蛋白表面的正净电荷增多,说明PKD结构域处理后能够导致胶原蛋白聚合体的解离。圆二色谱研究发现PKD结构域的结合不会导致胶原三螺旋结构发生变化,也没有对胶原三螺旋的热稳定性造成影响。由此,我们提出了MCP-01对胶原蛋白降解的作用机制模型图,与已报道的基质金属蛋白酶MMP对胶原蛋白的降解机制不同。4.MCP-01催化结构域的晶体结构及其对胶原蛋白的催化机制目前对哺乳动物基质金属蛋白酶MMP的胶原蛋白催化机制研究较为详细。MMP的催化腔较小,约有5（?）左右,难以容纳长度为3,000 A,直径为15 A的胶原蛋白纤维。MMP的Hxp结构域能够与三螺旋胶原蛋白结合,行使解旋酶作用,局部打开胶原蛋白螺旋,使胶原蛋白结构松散并露出单链,从而进入MMP催化腔。但目前对细菌胶原酶对胶原蛋白的催化机制研究很少。蛋白酶MCP-01与MMP不同,其催化结构域CD能够单独降解不可溶胶原蛋白底物,表明其催化腔可能能容纳胶原蛋白三螺旋分子。但这并不是subtilisin家族蛋白酶的共同特征。该家族的模式蛋白酶Carlsberg以及其他许多酶都不具有降解胶原蛋白的功能。为了研究蛋白酶MCP-01催化降解胶原蛋白的机制,我们首先对蛋白酶MCP-01的CD进行了结晶,通过X-射线衍射得到了CD的分子结构,分辨率为1.76 （?）,这是首次报道了一个丝氨酸家族胶原蛋白酶的晶体结构。对CD的结构分析表明,CD具有与Carlsberg相同的拓扑结构和催化三联体,但却具有更大的催化腔,约17 A。通过分子模拟,我们发现CD催化腔可以容纳直径为15（?）的胶原蛋白三螺旋分子。由于催化腔较大,底物进入CD时不需要发生构象变化。与之相比,Carlsberg的催化腔则较小,约13 A。通过分析CD和胶原蛋白肽的复合物中CD催化腔和胶原蛋白肽的相互作用发现,催化腔外侧的3个loop与酶的底物特异性有关,直接参与了酶对底物的捕获。比较CD和Carlsberg的催化腔外侧loop区发现,二者在这些loop区的氨基酸性质及其侧链长度不同。CD的loop中含有较多的酸性氨基酸和芳香族氨基酸。比较CD与已报道的其它S8家族丝氨酸胶原蛋白酶的氨基酸序列,发现在这些胶原蛋白酶中也具有较保守的酸性氨基酸和芳香族氨基酸。因此,它们可能是CD与胶原蛋白相互作用的关键残基。我们对这些氨基酸残基进行了定点突变,并测定了突变体的胶原酶活和酪蛋白酶活,发现D140、D202、P210、P256、F177和E102等氨基酸残基突变后,CD的胶原酶活力下降,因此这些残基可能直接参与了CD与胶原蛋白的相互结合。这些研究结果初步阐明了CD降解胶原蛋白的分子基础,并为阐明丝氨酸蛋白酶的功能进化研究奠定了基础。以上这些研究结果初步揭示了MCP-01对胶原蛋白的降解特性及机制。以MCP-01为代表,Deseasin类蛋白酶可能在深海沉积物中广泛存在并在深海PON的降解中发挥作用。我们的研究为进一步阐明包括deseasin在内的深海蛋白酶在深海沉积物HMWON的降解中发挥的作用提供了理论依据,并为开发具有新用途的蛋白酶奠定了理论基础。5.适冷蛋白酶MCP-01的肉类嫩化作用和嫩化机制胶原蛋白是肌肉结缔组织的重要组成部分,约占80%,是影响肉质嫩度的重要因素之一。MCP-01是目前唯一报道的适冷胶原蛋白酶。由于其在低温及室温下具有很高的胶原蛋白活性,因此可能在低温及室温下具有很好的肉类嫩化能力。为此,以牛肉为样品,我们研究了蛋白酶MCP-01对肉制品的嫩化能力和嫩化机制,并与目前商品化的嫩化酶木瓜蛋白酶Papain和菠萝蛋白酶Bromelain进行了比较。研究结果表明,在4℃下,经MCP-01处理的牛肉的剪切力的下降幅度与经菠萝蛋白酶处理后的基本相同,表明MCP-01可能具有与菠萝蛋白酶相似的肉类嫩化能力。MCP-01嫩化后的牛肉能保持新鲜色泽,具有较高的保水性,形状基本不变,而木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶嫩化后的牛肉失水率高,形状发生皱缩,颜色变暗。底物特异性研究表明,在4℃下,MCP-01降解胶原蛋白的能力明显高于Bromelain和Papain,表明MCP-01在嫩化过程中能高效降解结缔组织中的胶原蛋白。MCP-01与商品化的嫩化酶对牛肉肌细胞中的肌原纤维蛋白的选择性降解能力不同。Bromelain和Papain能够毫无选择性地将牛肉的肌球蛋白重链、肌动蛋白以及其它蛋白降解为30 kDa以下的小肽。而MCP-01仅能降解包括肌球蛋白重链在内的部分蛋白,对肌动蛋白基本没有降解作用。电镜观察表明,经蛋白酶MCP-01处理后的牛肉结构与经Bromelain和Papain处理的明显不同,这可能是它们嫩化机制不同造成的。这些研究结果表明,Deseasin MCP-01具有与目前商品化的嫩化酶不同的嫩化机制,是一种新型肉类嫩化酶,可能在肉制品的低温嫩化中具有应用潜力。
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相关论文文献
- [1].变性剂和缓冲系统对适冷蛋白酶MCP-01和中温蛋白酶BP-01构象影响的圆二色光谱分析[J]. 山东大学学报(理学版) 2013(01)
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