论文摘要
研究背景:国外及我们前期工作表明,体细胞端粒酶的激活是肿瘤细胞恶性转化并无限增殖的一个重要条件,端粒酶在85%以上的癌组织中表达,而正常体细胞内不表达或低表达。端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase, hTERT）是端粒酶的限速亚单位,直接决定端粒酶的活性。hTERT的表达水平与端粒酶活性呈平行关系,hTERT变化可准确反映细胞中端粒酶活性的变化。因此,端粒酶,更为准确地说,端粒酶亚单位hTERT活化导致端粒酶激活是肿瘤发生发展的重要环节。以往有关hTERT的调控研究多集中于转录水平,很少涉及转录后调控。miRNA是基因转录后调控的重要因素。至今已发现7百多条miRNA,约调控着1/3的蛋白编码基因。一些miRNA被证实在很多生理及病理过程中起着重要的作用,包括肿瘤的发生发展与转移。目前仅发现一条miRNA（miR-138）参与了hTERT的转录后调控。靶基因的转录后调控一般多有数条miRNA参与,因此我们推测还有其它miRNA参与hTERT转录后调控。研究方法:（1）采用生物信息学技术预测可能调控hTERT的miRNA;（2）采用miRNA芯片技术筛选可能参与调控hTERT的miRNA;（3）采用荧光实时定量PCR技术（real-time PCR）验证筛选的hTERT调控相关的miRNA;（4）采用特异的miRNA前体RNA序列（miRNA mimics）转染细胞,或负载miRNA表达序列的慢病毒感染细胞,上调细胞内miRNA的表达丰度;（5）采用Western blot和RT-PCR方法验证miRNA对靶基因hTERT的调控作用;（6）采用双荧光素酶实验验证miRNA对hTERT的靶向调控机制;（7）采用MTT实验及Transwell实验对hTERT调控相关的miRNA进行功能分析,观察这些hTERT调控相关的miRNA在体外对胃癌细胞株生物学行为的影响。研究结果:（1）利用生物信息学软件预测,发现57条miRNA可能调控hTERT的表达,并采用miRNA基因芯片技术,检测hTERT阳性的胃癌组织以及hTERT阴性的癌旁组织miRNA的差异,结合生物信息学预测结果,初步筛选到14条可能调控hTERT的miRNA;进一步采用real-time PCR进行验证,发现这14条miRNA中有9条可能在转录后水平调控hTERT表达;（2）采用负载相应miRNA的慢病毒感染人胃腺癌SGC-7901细胞后,Western blot结果显示有5条miRNA可下调hTERT的表达丰度,分别是hsa-miR-1266, 1182, 491-5p, 138, 1207-5p;（3）采用双荧光素酶实验及点突变实验证实上述5条miRNA可与hTERT mRNA 3’UTR结合,从而发挥对hTERT靶基因转录后翻译的抑制作用;（4） MTT实验表明以上5条miRNA在体外可有效抑制人胃癌细胞株SGC-7901的增殖,Transwell实验显示以上5条miRNA在体外可有效抑制人胃癌细胞株SGC-7901的侵袭能力。研究结论: （1）与hsa-miR-138一样,hsa-miR-491-5p、1266、1207-5p和1182等4条miRNA在转录后水平抑制其共同的靶基因hTERT的表达水平;其作用机制是通过结合于hTERT 3’UTR上互补序列而干扰hTERT mRNA的正常翻译;（2）与hsa-miR-138一样,hsa-miR-491-5p、1266、1207-5p和1182等4条miRNA对hTERT蛋白在转录后水平的调控是微调作用,只能有限下调hTERT表达丰度而不能完全抑制hTERT蛋白的表达;（3） hTERT调控相关的miRNA在体外可有效抑制人胃腺癌SGC-7901细胞株的增殖与迁移、侵袭能力,其机制可能是通过抑制hTERT的表达。综上所述,本研究新发现的4条hTERT调控相关的miRNAs,即miR-491-5p、1266、1207-5p和1182,丰富了hTERT调控的理论体系,为胃癌的防治研究提供了新的靶点。
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