登革热湿热特征及清热利湿法抗登革脑炎脑屏障损伤机理研究

论文摘要

研究背景登革热迄今至少有200多年的历史。在历史上，登革热有过许多次大流行。进入20世纪，登革热在世界范围内的流行规模不断扩大，流行频度不断增加。最近10年，由于城市化扩大，人口的快速增长，垃圾处理不当，国际旅游增多，全球登革热的流行情况呈不断上升趋势，已广泛分布于100多个国家和地区，对25亿人的健康构成威胁，成为继疟疾之后的最重要的热带病。中枢神经系统（CNS）病变在登革热病人的发生率为1．6％～4．3％，原有中枢神经系统病变者，登革病毒性脑炎发病率又增加3～5倍，而登革脑炎患者则更易发展为DHF／DSS。登革热疫苗预防接种尚处于研究试验阶段，虽近期有多篇文章报道了泰国Mahidol大学的研究者们在原代狗肾细胞中培养了活的减毒株，候选的单价、双价、三价和四价疫苗在泰国进行了Ⅰ期和Ⅱ期实验，取得了满意的结果，但由于担心活的减毒疫苗会回复到有毒株，目前正在努力通过DNA重组技术产生单位疫苗。故近期内尚无可供广泛使用的疫苗。登革热治疗目前尚无特效方法，主要采用对症、支持疗法。故在发热等症出现的早期，如何确诊、如何辨别轻型与重型，并对重型者，特别是已出现登革脑炎症状者，及早合理干预，是至关重要的。而在登革热早期诊断中，流行病学、临床表现、血清特异性IgM抗体检测、DV的分离或登革热抗原检测均显苍白无力。因此登革热早期中医证治特点的研究便显得甚为重要。研究目的通过文献资料、临床病案及三种复合因素（DV感染、高脂饲料喂养、外环境湿热）共同干预所建立的BALB／C小鼠DV感染湿热证模型的综合研究，探讨登革热湿热特征和清热利湿法抗登革脑炎血脑屏障损伤的作用机理，为临床登革热及登革脑炎的防治提供指导。研究方法1临床研究按由近及远顺序，从广州市第八人民医院病案室采集2002年～2006年登革热病案共1200份。按笔录-梳理（统一辨证）-建库-表列-统计过程分步进行。所有病例经专科教授集中审核，按统一标准重新编制。统一采用SPSSV13．0统计软件包，对登革热发生流行时的气候特点，临床表现，实验室检查结果，并发症，中医病位、病性、证型及其变证的证型等进行统计分析。2实验研究先通过4个实验摸索出：①内湿热形成的条件——高脂饲料喂养4d；②在内湿热基础上，外湿热环境及干预时间——温度32±0．5℃，湿度60±5%，干预时间2h；③DV接种方法与接种量的探索——颅内接种，病毒液稀释浓度10-3；④三种因素干预顺序——先高脂饲料、正常饮水喂养4d，第5d给予DV颅内接种+外湿热环境；或DV颅内接种+高脂饲料、正常饮水喂养4d，第5d施予外湿热环境。再采用“颅内接种病毒+高脂饲料喂养+间断湿热外环境刺激”三种复合因素构建BALB／C小鼠登革病毒感染湿热证模型，在此基础上探讨清热利湿法抗登革脑炎脑屏障损伤的机理。将56只实验用BALB／C小鼠随机分成7组，每组8只。常规驯养2天后干预。A正常组普通饮食、正常饮水；B单纯DV感染组正常饮食饮水+DV感染；C DV感染+外湿热组正常饮食饮水+DV感染+置于气候模拟仓中；D DV感染+内湿热组高脂饲料、正常饮水喂养+DV感染；E模型组高脂饲料、正常饮水喂养+DV感染+置于气候模拟仓中；F中药1组在模型组基础上给予蒿芩清胆汤灌胃；G中药2组在模型组基础上给予银翘散去牛蒡子、元参+杏仁、滑石方汤灌胃。根据前面造模条件摸索，为了操作方便，模型组及治疗组选用先DV颅内接种+高脂饲料、正常饮水喂养4d，再施予外湿热环境的干预顺序。除正常组外，于第1d 7：30AM开始，所有小鼠均给予DV颅内接种，同时给予相应饮食、正常饮水喂养。分别于第5d、7d、9d 10AM施予外湿热环境（使用前面摸索的条件）。中药灌胃予第5d开始实施，每日两次（9AM、5PM），每只0．4ml／次，连续灌胃4d（第5～8d）。第9d，剖取所有组小鼠肝脏、脑组织，采用4％的多聚甲醛固定，放入4℃保存待测。其中A、B组小鼠在自然环境下操作；C、E、F、G组小鼠则在第三次施予外湿热环境干预2h后，直接在气候模拟舱内操作。体重、肛温的检测分别在第1d、5d、7d、9d的7：5 0AM进行。肝、脑内NF-κB和脑内AQP4、MMP9、GLUT1的表达水平的免疫组化检测及肝、脑组织切片由广州达辉生物有限公司完成。采用SPSS13．0软件统计包分析结果，数据均以均数加标准差标示（（?）±s），采用t检验或q检验，P<0．05为显著性差异。附三种复合因素干预BALB／C小鼠模型建立实验流程简图：研究结果1临床结果1200份病案，多发生在高温高湿气候环境，总体上病情较轻，重症登革热较为少见。出现脑膜脑炎者均在病程第4～6天发生。临床表现以剧烈头痛，谵妄，神智改变为主，查体可见颈项强直、克氏（Kemig）或布氏（Brudzinski）征阳性。经治疗后，多于2-4天症状明显缓解，无后遗症表现。辨证以湿热为主，湿热病邪是病变过程中主要致病因子。每例患者平均涉及病位3～4个，可能与湿热弥漫，毒邪随之流窜，多脏腑功能受损有关。证型以卫气同病、邪伏膜原等湿热证为主，但有湿热偏重的不同。湿热熏蒸、毒陷清窍则发生登革脑炎。2实验结果造模所用4周龄BALB／C小鼠为幼鼠，正常组小鼠体重逐渐增加，体温逐渐略有下降，符合幼鼠发育规律。单独DV感染小鼠，出现一过性活动、进食、摄水量减少。与正常组比较，体重变化无显著性差异（P>0．05）；肛温骤升骤降，终可至正常。肝、脑组织内NF-κB及脑组织内AQP4、MMP9、GLUT1平均光密度表达水平上调，与正常组和模型组比较，均差异显著（P<0．05）；与单纯外或内湿热+DV病毒感染小鼠比较，无显著性差异（P>0．05）。肝、脑组织切片显示：肝、脑细胞轻度受损。这与临床轻型登革热表现类似，可自愈。外或内湿热加DV病毒感染小鼠，肛温先骤升骤降，降至一定程度（相当于低热）后，下降缓慢，终可至正常。前者（外湿热+DV病毒感染小鼠）在气候模拟舱内先出现一段时间躁动期，活动、饮水量增多，汗出、体毛结穗，继而进入安静状态，活动减少，散在静卧，然整体来说是活动、进食、摄水量减少，体重下降；后者（内湿热+DV病毒感染小鼠）则先出现活动、进食、摄水量增加，体重增长，皮毛油亮光泽，粪便及排泄物增多，随后表现为蜷缩扎成堆，活动量、进食量、摄水量减少，粪便稀溏。肝、脑组织内NF-κB及脑组织内AQP4、MMP9、GLUT1平均光密度表达水平上调，与正常组和模型组比较，均差异显著（P<0．05）；与单纯DV病毒感染小鼠比较，差异无显著性（P>0．05）。肝、脑组织切片显示：肝细胞中度受损，脑细胞轻度受损。这与临床典型登革热表现类似，因有内或外湿热病邪的干预，病程相对轻型较长，一般预后较好。内外湿热加DV病毒感染小鼠，先出现躁动，进食、摄水量、体重增加，皮毛油亮光泽，粪便及排泄物增多，随后表现为蜷缩扎成堆，活动量、进食量、摄水量减少，粪便稀溏。随着病情的进展，小鼠反应迟钝，体毛开始脱落，体重减轻，进食量及活动明显减少，出现弓背、后肢瘫痪等脑部症状表现后，于1～2d内死亡。肛温先骤升，升至一定程度（相当于中、高热）后，缠绵不降。肝、脑组织NF-κB及脑组织AQP4、MMP9、GLUT1平均光密度表达水平明显上调，差异显著（P<0．05）。肝、脑组织切片显示：肝细胞体积增大，部分破裂，细胞核周围及胞浆内出现大量空泡，大小不等；脑组织多数神经细胞核固缩，核仁显不清，细胞外空隙明显增宽、间质疏松，显示细胞周围及间质水肿明显。这与临床重型登革热表现类似，死亡率极高。分别给予蒿芩清胆汤及银翘散去牛蒡子、元参+杏仁、滑石方汤干预小鼠，于干预后第2d（即第6d）开始，活动、进食、摄水量渐增，粪便渐接近正常，第7天肛温已降到与正常组差异无显著性（P>0．05）。肝、脑组织内NF-κB及脑组织内AQP4、MMP9、GLUT1平均光密度表达水平与正常组比较，差异无显著性（P>0．05）。肝、脑组织切片显示：肝、脑细胞有少许变化，但大致正常。研究结论1登革热的发生流行与当时的环境因素（温度、湿度）关系密切；湿热体质者为易感人群。湿热体质者在湿温环境中更易出现登革脑炎、DHF／DSS等并发症。登革脑炎证型为湿热熏蒸、毒陷清窍，是DV感染开始至DHF／DSS发生的一个中间过程。2单纯DV感染小鼠，表现类似临床轻型登革热，病程3～5天，即可自愈；外或内湿热加DV病毒感染小鼠，与临床典型登革热表现类似，病程5～10天，预后较好；内外湿热相引加DV病毒感染小鼠，与临床重型登革热表现类似，出现脑炎表现者，死亡率极高。3模型小鼠发病之初，给予蒿芩清胆汤与银翘散去牛蒡子、元参+杏仁、滑石方干预，可阻止NF-κB、AQP4、MMP9、GLUT1的表达上调，使血脑屏障免受破坏，从而防止登革脑炎的发生。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 引言
• 上篇 理论研究
• 第一节 登革热及登革脑炎西医研究概况
• 1 病原学与分子生物学
• 2 登革病毒的传播
• 3 流行概况、特征及影响因素
• 4 诊断标准与技术
• 5 治疗与转归
• 6 预防与免疫
• 7 登革脑炎概况
• 第二节 登革热中医证治特点研究概况
• 1 登革热中医辨治概况
• 2 登革热湿热特征分析
• 3 小结
• 第三节 蒿芩清胆汤和银翘散加减方治疗感染性疾病浅析
• 1 蒿芩清胆汤治疗感染性疾病述略
• 2 银翘散加减方治疗感染性疾病述略
• 第四节 影响血脑屏障通透性的因素
• 1 脑屏障的发现、组成及意义
• 2 决定脑屏障通透性的因素
• 3 AOP4、MMP9、GLUT1对血脑屏障通透性的影响
• 中篇 临床研究
• 1 研究对象与方法
• 2 结果及分析
• 3 讨论
• 下篇 实验研究
• 第一节 三种因素造模条件及干预顺序摸索
• 1 高脂饮食喂养形成内湿热的时间摸索
• 2 外湿热环境温度、湿度及干预时间的摸索
• 3 登革病毒接种方式、剂量的摸索
• 4 三种因素干预顺序摸索
• 第二节 荧光定量方法检测登革病毒感染的可行性
• 1 实验目的
• 2 实验材料
• 3 实验方法
• 4 实验结果
• 5 讨论
• 第三节 模型的建立及清热利湿法抗脑屏障损伤机理探讨
• 1 实验目的
• 2 实验材料
• 3 实验方法
• 4 实验结果
• 5 讨论
• 结语
• 1 理论研究结论
• 2 临床资料分析结论
• 3 实验研究结论
• 4 创新点
• 5 存在的问题及今后研究方向
• 参考文献
• 附录
• 在学期间发表论文情况
• 致谢