论文摘要
人同源Brck1基因（hHBrk1）是本实验室应用抑制性消减杂交技术从人支气管上皮恶性转化细胞系BERP35中克隆到的差异表达基因。由于与玉米的Brick1有高度同源性,因此命名为hHBrk1。hHBrk1在动植物界高度保守,编码一种微丝相关蛋白,参与微丝的聚合。hHBrk1基因（GenBank:AY148219）,又名HSPC300、C3ORF10及MDS027,位于3号染色体短臂25.3-24.1区,与抑癌基因VHL邻近,由3个外显子和2个内含子构成,编码75个氨基酸残基,分子量约9 Kd。hHBrk1能与Rho GTP酶的效应分子WAVE1的SHD区相互作用,参与微丝成核作用,调节细胞运动。hHBrk1蛋白家族在第47～67位氨基酸残基存在一个七重复（heptaed repeat, HR）结构域,此结构域可形成特殊的卷曲螺旋,是介导蛋白质相互作用的重要结构。前期的研究表明hHBrk1可能通过促进微丝的异常聚合参与肿瘤的迁移。本研究的第一阶段首先利用组织谱阵列芯片技术构建了hHBrk1在多肿瘤及癌旁正常组织差异表达谱。筛选出了hHBrk1基因表达上调的肺癌组织和表达下调的肾癌组织。接着,通过半定量RT-PCR技术对8对16例肺癌及癌旁正常组织的hHBrk1基因表达差异进行检测,验证了hHBrk1在肺癌与癌旁正常组织中的差异表达。第二阶段,以实验室前期构建的pGEX4T-hHBrk1为基础,原核表达了融合蛋白GST-hHBrk1,运用GST-pulldown实验结合蛋白质肽指纹质谱分析技术得到了hHBrk1相互作用蛋白质肌球蛋白Ⅵ。肌球蛋白Ⅵ属于肌球蛋白超家族成员,Yoshida发现肌球蛋白Ⅵ基因高表达的卵巢癌细胞容易向腹腔播散;而微丝聚合促进因子WAVE2则与黑色素瘤的浸润表型有关,该结果提示hHBrk1与肌球蛋白Ⅵ相互作用形成复合物可能与肿瘤浸润转移中的作用机制密切相关。为了进一步验证实验结果的可靠性,我们构建了hHBrk1原核表达载体pGBTNH-hHBrk1并获得了融合蛋白His-hHBrk1在大肠杆菌中高效表达。并以此为基础,在95D细胞的裂解液中完成了hHBrk1与肌球蛋白Ⅵ的免疫共沉淀,验证了hHBrk1与肌球蛋白Ⅵ的相互作用。运用激光共聚焦技术,观察到了hHBrk1与肌球蛋白Ⅵ共定位于95D细胞的胞浆。第三阶段,分别构建了hHBrk1的突变缺失体和肌球蛋白Ⅵ的各功能区截短体,在原核和真核获得了融合蛋白的表达,通过免疫共沉淀技术鉴定了hHBrk1与肌球蛋白Ⅵ的作用位点位于肌球蛋白Ⅵ的卷曲螺旋区（Coiled-coil）、球状区（Globular Domain）和hHBrk1的羧基端第47-69位氨基酸。。
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相关论文文献
- [1].hHBrk1与WAVE1蛋白相互作用位点的鉴定[J]. 中国病理生理杂志 2011(03)
- [2].肿瘤谱阵列芯片技术分析人体不同癌组织hHBrk1基因的差异表达[J]. 安徽医科大学学报 2008(03)