JWA在三氧化二砷诱导HeLa和MCF-7细胞凋亡中的作用及分子机制

论文摘要

三氧化二砷（As2O3）已经成为治疗新确诊的和复发的急性早幼粒细胞白血病（APL）的经典药物,其治疗APL的主要机制是诱导白血病细胞发生凋亡。As2O3的促凋亡作用不仅局限于APL细胞,对一些其他类型白血病及包括肝癌、前列腺癌、肾癌、食管癌、宫颈癌和膀胱癌在内的实体瘤细胞均有促凋亡作用。As2O3的作用机制复杂,在白血病细胞中主要通过作用于PML-RARα和PML蛋白而诱导分化和凋亡,但是As2O3诱导实体瘤细胞凋亡的机制还不完全清楚。As2O3可通过产生活性氧（ROS）,活化MAPK家族蛋白分子,抑制Bcl-2家族成员蛋白表达,损伤线粒体膜电位,释放线粒体色素C,激活caspases（caspase-3,-8和-9）等信号通路诱导肿瘤细胞凋亡。As2O3作用的信号通路多且复杂,并且由于特定细胞的组织起源和特异性不同而不同。As2O3的生物学作用受剂量或浓度、作用时间等因素影响。JWA基因（AF070523.1）是周建伟等1998年发现,从培养的原代人气管和支气管上皮细胞中分离并克隆的受维甲酸诱导的新的细胞骨架样基因。通过对其结构分析发现,JWA基因启动子序列中含有多种反应元件,如TPA（12-O-tetradecanoyl-phorbol-13 acetate）反应元件（TRE）、hemin反应元件（HRE）、热休克反应元件（hRE）、应激反应元件（SRE）和ATRA反应元件（ARE）半位点等。在JWA编码蛋白中有两个含丝氨酸残基的PKC（protein kinase C）磷酸化位点（SDR-SLR）。本课题组多年来一直围绕JWA基因的结构、功能及其相互关系开展研究工作,取得了一系列原创性有意义的研究成果。先后证实JWA是一种新的微管相关蛋白（microtubule-associatedprotein,MAP）,不仅广泛地参与调节多种分化和/或凋亡诱导剂（如TPA,ATRA,4HPR和As2O3）涉及的信号通路,而且活跃地参与细胞对应激刺激（如氧化应激和热应激）的应答,但是JWA参与细胞凋亡的具体机制尚不明确。本研究主要应用As2O3为凋亡诱导剂,采用多种分子细胞生物学实验技术,以实体瘤细胞宫颈癌细胞HeLa,乳腺癌细胞MCF-7为模型,探讨JWA参与As2O3所诱导的实体瘤细胞的凋亡及可能机制。一方面,通过对As2O3诱导实体瘤细胞凋亡的机制作进一步探讨,为基因干涉JWA和As2O3联合运用提高As2O3对实体瘤的疗效提供理论和实验依据,进而对治疗和预防肿瘤提供新的科学依据;另一方面,初步阐明JWA参与凋亡的信号通路和分子机制,为最终阐明JWA基因的结构、功能及其相互关系提供证据。一.JWA活跃地应答As2O3诱导HeLa和MCF-7细胞凋亡用HoechSt 33258染色、TUNEL流式细胞术、Annexin V-PE流式细胞术三种方法测As2O3诱导HeLa,MCF-7细胞凋亡,结果发现细胞凋亡率与As2O3的处理浓度呈剂量反应关系,但HeLa细胞对As2O3诱导凋亡更为敏感:5μM As2O3诱导HeLa细胞48h,凋亡率约100%,而5μM As2O3诱导MCF-7细胞48h,凋亡率约为25%。同时用Western Blot检测JWA蛋白表达,发现JWA蛋白表达与As2O3浓度间呈剂量依赖性关系。提示JWA可能参与As2O3诱导HeLa和MCF-7细胞凋亡的发生机制。二、JWA是As2O3诱导HeLa和MCF-7细胞凋亡的必需分子为了探讨JWA是否为As2O3诱导HeLa和MCF-7细胞凋亡的必需分子,我们成功构建了JWA表达缺陷细胞株,采用Hoechst 33258染色,MTT实验检测As2O3处理JWA表达缺陷细胞株后的凋亡率、生长抑制的改变,结果发现在As2O3处理的JWA表达缺陷细胞,与对照相比,其凋亡和生长抑制显著减弱。采用回复模型,即将JWA高表达的质粒转染到JWA表达缺陷的细胞中,使得JWA的蛋白表达水平恢复正常后,As2O3诱导细胞凋亡的水平也升高至对照水平。提示JWA表达对于As2O3诱导HeLa和MCF-7细胞凋亡可能是必需的。三、JWA通过线粒体通路调节As2O3诱导的细胞凋亡细胞凋亡的发生机制主要涉及线粒体通路和与线粒体无关的死亡受体通路。为进一步探讨JWA调节As2O3诱导HeLa和MCF-7细胞凋亡的机制,我们首先需要甄别JWA的作用与哪条信号通路有关。通过检测As2O3处理JWA表达缺陷细胞和对照细胞中这两条通路上特异性天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶caspase-8,caspase-9的差异,发现caspase-9在JWA表达缺陷细胞中剪切显著减少即凋亡显著减弱,而caspase-8无显著变化;在JWA回复转染模型中,As2O3诱导caspase-9剪切的水平又显著增加,说明JWA在As2O3诱导HeLa和MCF-7细胞凋亡中主要通过caspase-9通路（即线粒体通路）而非死亡受体通路起促凋亡作用的。继而我们又检测线粒体通路上与caspase-9活化密切相关的线粒体膜电位的变化,用罗丹明123标记,流式细胞仪检测在As2O3处理JWA表达缺陷细胞和对照细胞24h线粒体膜电位变化的差异,发现在JWA表达缺陷细胞,As2O3诱导的线粒体膜电位损伤被明显抑止,这从另一角度说明JWA是通过线粒体通路影响As2O3诱导细胞凋亡的。四、As2O3通过诱导ROS活性氧产生诱导JWA表达ROS是引起线粒体膜损伤的重要原因之一,ROS也是As2O3诱导细胞凋亡的主要分子,我们推测JWA对As2O3诱导细胞凋亡的影响可能与ROS相关。用DCFH-DA染色5μM As2O3处理的HeLa细胞,发现短时间内（1h）ROS显著增加,5μM As2O3处理HeLa细胞24h诱导的细胞凋亡率和JWA蛋白表达也显著增加。然而,当联合使用过氧化氢酶（catalase）去除细胞内H2O2后,As2O3诱导的ROS几乎被完全抑制,说明ROS主要是以H2O2的形式存在;用过氧化氢酶处理HeLa细胞24h后,As2O3诱导的细胞凋亡被显著抑制,同时JWA表达水平也显著下降,甚至低于正常水平。这些结果说明H2O2可能作为As2O3的氧化代谢产物在其诱导细胞凋亡中发挥至关重要的作用;而JWA表达可能由于As2O3诱导产生H2O2诱导;ROS/JWA可能是与As2O3诱导细胞凋亡机制密切相关的分子。五、JWA对As2O3诱导细胞凋亡信号分子的影响MAPK信号分子是细胞凋亡线粒体通路上的重要分子,Bcl-2家族蛋白成员也是依赖线粒体凋亡通路上的重要的调节分子。我们推测JWA的作用可能是通过对MAPK信号分子以及Bcl-2家族蛋白成员的影响而实现的。用As2O3（0,5μM）处理对照C1-HeLa和JWA表达缺陷的HeLa细胞（asJWA-HeLa）24h,采用Western Blot检测MAPK信号分子和Bcl-2家族蛋白的变化,结果发现,在asJWA-HeLa细胞,MEK,ERK1/2和JNK的磷酸化几乎被完全抑制,而它们的本底水平（非磷酸化分子）没有发生明显变化;同时,As2O3诱导激活的磷酸化Bad水平在asJWA-HeLa细胞中进一步增加,而Bad和Bcl-2本底水平也没有发生显著变化,说明JWA是通过对MAPK分子和Bcl-2家族成员的作用影响As2O3诱导细胞凋亡的。综上所述,本研究发现:（1）在HeLa和MCF-7细胞中,As2O3可通过诱导产生H2O2诱导JWA表达增加,从而引起一系列凋亡相关信号转导的发生;（2）JWA是As2O3诱导活化MEK-ERK,JNK通路且与线粒体膜电位,caspase-9活化密切相关的重要分子;（3）As2O3诱导的Bad的活化可能受JWA的调节,然而,其机制尚未清楚,JWA对Bad活化的作用可能通过MEK-ERK/JNK途径,也可能是MEK-ERK/JNK以外的通路。JWA参与As2O3诱导凋亡的信号通路可能为:As2O3→H2O2→JWA→MAPK家族（MEK-ERK,JNK）→Bcl-2家族（Bad,Bax）→线粒体膜电位→线粒体色素C→caspase-9→凋亡。

论文目录

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