蜡梅病程相关蛋白基因CpPR-1的克隆及功能初步分析

论文摘要

病程相关蛋白（pathogenesis-related protein,PRP）是植物在受到一些化学物质的诱导、盐害、病原物（如真菌、细菌、病毒）的侵染等逆境胁迫时发生一系列防卫反应时产生出一些新的蛋白质。迄今为止,随着研究的不断深入,已经在30多种植物中诱发到了病程相关蛋白并得到了克隆。PR蛋白可分为PR-1、PR-2、PR-3、PR-4等共17类。其中PR—1家族在受病原或水杨酸诱导的PR蛋白中占据着统治地位,植物PR-1在结构上具有高度序列保守性。在已有的研究基础上,从蜡梅cDNA文库中克隆了一个蜡梅病程相关蛋白1基因,并对基因的编码蛋白进行生物信息学分析及功能初步预测,通过构建植物表达载体,利用根癌农杆菌介导的叶盘法转化烟草,对转基因烟草进行胁迫研究,分析PR-1蛋白基因的功能。主要研究结果如下：1.CpPR-1及编码蛋白的生物信息学分析在已经构建的蜡梅花cDNA文库及EST分析的基础上,通过文库cDNA全长测序,得到了大小为得到其全长为1199bp,包含1个486bp的ORF,编码蛋白由161个氨基酸残基组成,其中碱性氨基酸14个,酸性氨基酸21个,无内含子的存在。2.植物表达载体的构建将该基因的的cDNA编码序列连接到植物表达载体pCAMBIA2301g中,经过酶切和PCR验证,成功构建了克隆载体pCAM-CpPR-1.为进一步通过转基因技术研究该基因的功能奠定了基础。3.对烟草的遗传转化通过农杆菌介导将含有蜡梅病程相关蛋白基因CpPR-1的植物表达载体转入野生烟草中,经过GUS染色,Km+抗性筛选检测,和转化烟草]ONA PCR检测,获得转基因植株含CpPR-1基因的的有11株。4.转基因植株的胁迫分析50mM CuS04处理5天后对照和转基因植株生长状况出现明显差异,野生型植株严重萎蔫,转基因植株生长基本正常,有轻微萎蔫症状,初步说明蜡梅PR-1基因可能具有抗重金属胁迫的功能。接种烟草花叶病毒7天后,转基因烟草和野生型烟草均出现一定的感病症状,枯斑大小及数量无明显差异,这表明烟草PR-1基因的表达对TMV病毒无明显抗性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 文献综述
• 1.1 病程相关蛋白的发现及命名
• 1.2 病程相关蛋白的分类与特征
• 1.3 病程相关蛋白的合成与表达
• 1.3.1 病程相关蛋白的诱导
• 1.3.2 病程相关蛋白的合成
• 1.4 病程相关蛋白的抗病机制
• 1.4.1 抗病原菌活性
• 1.4.2 植物生长发育调控
• 1.4.3 加固细胞壁
• 1.5 病程相关蛋白PR-1家族
• 1.5.1 PR-1家族的分类
• 1.5.2 PR-1蛋白的结构模型
• 1.5.3 PR-1基因家族的特性
• 1.5.4 PR-1基因的功能
• 第2章 引言
• 第3章 蜡梅CpPR-1基因的克隆与序列分析
• 3.1 技术路线
• 3.2 实验材料与试剂
• 3.2.1 蜡梅花cDNA文库
• 3.2.2 菌株与载体
• 3.2.3 主要仪器设备
• 3.2.4 主要化学试剂
• 3.2.5 自配的主要试剂和常用培养基配方
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 EST序列特征分析
• 3.3.2 CpPR-1基因cDNA的获得
• 3.3.3 CpPR-1基因cDNA的生物信息学分析
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 CpPR-1克隆子的获得及其cDNA序列特征
• 3.4.2 CpPR-1编码蛋白相似性比较
• 3.4.3 编码蛋白性质与结构特征分析
• 3.5 小结
• 第4章 表达载体的构建与烟草转化
• 4.1 技术路线
• 4.2 实验材料
• 4.2.1 植物材料
• 4.2.2 菌株与载体
• 4.2.3 主要仪器及生化试剂
• 4.2.4 常用溶液配方
• 4.2.5 常用培养基
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 植物表达载体的构建
• 4.3.2 转化烟草及阳性植株的筛选
• 4.3.3 转基因植株的检测
• 4.3.4 转基因植株的重金属胁迫实验
• 4.3.5 转基因烟草的抗病毒分析
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 CpPR-1基因表达载体的构建
• 4.4.2 烟草外植体的遗传转化
• 4.4.3 转基因植株的检测
• 4.4.4 转基因植株的胁迫研究
• 4.5 小结
• 第5章 讨论
• 5.1 CpPR-1基因全长cDNA及编码蛋白的特征
• 5.2 植物表达载体的构建
• 5.3 烟草的遗传转化
• 5.4 转基因烟草的胁迫研究
• 第6章 总结
• 6.1 结论
• 6.2 下一步工作打算
• 参考文献
• 缩略词表
• 致谢
• 在学期间发表的论文和研究项目