烟草中稳定表达的p25抑制PVY~N CP介导的RNA沉默

论文摘要

RNA沉默是一种依赖核酸序列特异性的抗病毒防御机制,而针对寄主的这种防御机制,许多病毒演化出RNA沉默抑制子以克服这种防御反应,两者在互作过程中存在动态的协同进化现象,同时也受到一些环境因素的影响。PVX是马铃薯X病毒属的典型成员,易造成马铃薯病毒性退化。它所编码的25kD蛋白（p25）是一种运动蛋白,近些年许多研究发现这种蛋白不但决定了病害的发生程度,同时还与PVX的运动、长距离扩散及系统症状产生有关,p25可能负责介导病毒在植物体中的传播,这一过程通过运动蛋白和植物细胞的一些亚细胞结构的相互作用来完成。同时研究发现p25还是一种沉默抑制子。本研究的主要内容是:以野生型烟草为材料,转PVX p25基因,获得稳定表达p25的转基因植株,再与高度抗病的表达马铃薯Y病毒坏死株系外壳蛋白基因（PVYN CP）的转基因烟草进行常规杂交育种,播种后从子代中筛选含p25和CP基因的双转基因植株,通过抗病性分析和分子杂交,探讨烟草中稳定表达的p25对RNA沉默介导抗病性的影响;并通过透射电镜观察研究稳定表达的p25对转基因烟草叶片的胞间连丝孔径的影响。结果如下:1.本研究利用实验室已构建的含PVX p25基因的克隆载体pUC19,XbaI和SacI双酶切获得p25基因,将其连接到植物表达载体pBI121上,农杆菌介导法转化野生型烟草获得转基因植株。Western blot检测表明,转基因植株成功表达出p25蛋白。2.透射电镜检测表明,稳定表达p25的转基因植株叶片胞间连丝孔径较野生型增大3-6倍。这说明烟草中稳定表达的p25与PVX产生的p25有类似的作用,也能够作用于胞间连丝,增加胞间连丝的体积排阻极限,有利于病毒在细胞间运动。3.利用PVYNCP基因介导的高抗转基因烟草为父本,稳定表达p25的转基因烟草去雄后与之进行常规杂交,从子代中筛选获得了含p25和CP基因的双转基因植株。4.对双转基因植株进行PVYN接种进行抗病性检测,接种后第7天表现为系统感病,出现典型退绿斑症状。采用ELISA定期对PVYN接种的双转基因植株进行抗性检测,在接种植株中检测出高滴度的PVYN。这表明,PVX p25、PVYN CP的双转基因植株中,稳定表达的p25导致了转基因植株的抗病性丧失。5. Northern杂交表明,双转基因植株中PVYN CP RNA表达水平明显高于发生RNA沉默的父本植株。因此认为,PVX p25、PVYNCP的双转基因植株中,稳定表达的p25抑制了PVYNCP基因介导的RNA沉默,且转基因植株抗病性的丧失与p25对RNA沉默的抑制作用有关。

论文目录

• 符号及缩略词说明
• 摘要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 RNA 沉默现象的发现
• 1.2 参与RNA 沉默的细胞组分
• 1.3 RNA 沉默的机制
• 1.4 RNA 沉默介导的病毒抗性
• 1.5 植物中RNA 沉默的抑制
• 1.5.1 植物编码的沉默抑制子的发现
• 1.5.2 植物编码的沉默抑制子的特点
• 1.5.3 沉默抑制子的主要研究方法
• 1.6 本研究的目的意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 病毒毒源
• 2.1.3 PCR 引物
• 2.1.4 菌株、质粒
• 2.1.5 抗血清
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 植物表达载体的构建
• 2.2.1.1 目的片段与植物表达载体的连接
• 2.2.1.2 重组质粒向大肠杆菌的转化
• 2.2.1.3 重组质粒向农杆菌转化（冻融法）
• 2.2.1.4 转化菌落PCR 鉴定
• 2.2.1.5 转化菌落酶切鉴定
• 2.2.2 农杆菌介导的烟草转化
• 2.2.3 常规杂交获得双转基因植株
• 2.2.4 转基因烟草的PCR 鉴定
• 2.2.5 转基因烟草的ELISA 检测
• 2.2.6 病毒接种鉴定
• 2.2.7 胞间连丝的透射电镜观察
• 2.2.8 WESTERN BLOT 检测
• 2.2.8.1 烟草叶片总蛋白质的提取
• 2.2.8.2 半干法蛋白转移
• 2.2.8.3 免疫检测
• 2.2.8.4 显色法检测蛋白质
• 2.2.9 NORTHERN BLOT 检测
• 2.2.9.1 植物总RNA 的提取
• 2.2.9.2 在含有甲醛的凝胶上进行RNA 电泳
• 2.2.9.3 转膜及烘膜
• 2.2.9.4 探针的合成
• 2.2.9.5 预杂交及杂交
• 2.2.10 SOUTHERN BLOT 检测
• 2.2.10.1 植物总DNA 的提取（SDS 法）
• 2.2.10.2 限制性内切酶消化
• 2.2.10.3 转膜（DNA 碱转移）
• 2.2.10.4 探针合成
• 2.2.10.5 预杂交及杂交
• 3 结果与分析
• 3.1 P25 转基因烟草的获得及鉴定
• 3.1.1 植物表达载体的构建
• 3.1.2 P25 转基因植株的获得
• 3.1.3 P25 转基因植株的PCR 鉴定
• 3.1.4 P25 转基因植株的NORTHERN BLOT 分析
• 3.1.5 P25 转基因植株的WESTERN BLOT 分析
• 3.1.6 P25 转基因植株胞间连丝的透射电镜观察
• 3.1.7 P25 转基因植株的ELISA 检测
• N CP 转基因植株后代抗病性检测'>3.2 PVY^N CP 转基因植株后代抗病性检测
• 3.3 双转基因植株的 SOUTHERN BLOT 分析
• 3.4 双转基因植株的抗病性分析
• 3.5 双转基因植株的 NORTHERN BLOT 分析
• 4 讨论
• 4.1 P25 对转基因烟草叶片胞间连丝孔径的影响
• N CP 介导的抗病性的影响'>4.2 P25 对PVY^N CP 介导的抗病性的影响
• N CP 介导的 RNA 沉默的影响'>4.3 P25 对 PVY^N CP 介导的 RNA 沉默的影响
• 5 结论
• 参考文献
• 附录Ⅰ 常用缓冲液及培养基的配制
• 附录Ⅱ 常用化学试剂、分子生物学试剂及仪器
• 致谢
• 硕士研究生阶段发表的综述及论文