橡胶树超高产单株与普通株胶乳差异表达基因的筛选及初步分析

论文摘要

天然橡胶（顺式-1,4-聚异戊二烯）具有优异的弹性、伸展性、绝缘性和热稳定性,是一种重要的工业原料和不可或缺的战略物资,我国严重短缺,大部分依赖进口。由于地处非传统植胶区,我国的天然橡胶产业是一种严格的资源约束型产业,目前可供扩大的植胶面积已十分有限,大幅度提高单位面积产量已成为我国天然橡胶产业发展的唯一可靠出路。在我国西双版纳垦区发现的超高产橡胶树单株,产量是普通橡胶树的10倍以上,为橡胶树高产机理研究提供了宝贵的实验材料。解析这些橡胶树单株超高产的分子机理,将为橡胶生产上大面积重现超高产现象奠定基础,也为橡胶树高产育种和橡胶树生产技术的革新提供理论依据和技术指导。本文以超高产橡胶树PR107单株及其邻近对照株为材料,利用cDNA-AFLP技术筛选胶乳差异表达基因,通过对所分离差异片段的测序、进一步鉴定及生物信息学分析,结合对橡胶生物合成基因的表达分析,初步探讨了橡胶树超高产的可能机理。主要研究结果如下:1.建立了适于橡胶树胶乳转录组分析的银染cDNA-AFLP技术根据本实验室现有条件,在经典cDNA-AFLP技术基础上进行改进和优化,通过合适酶切组合的选择、最优PCR反应参数的获取以及银染结果的优化等实验,建立了一套适于橡胶树胶乳转录组分析的银染cDNA-AFLP技术。该技术的优点是灵敏度高、重复性好,理论上可覆盖橡胶树胶乳转录组的90%以上。2.全面筛选了在超高产橡胶树和普通橡胶树胶乳中显著差异表达的基因利用我们自己建立的银染cDNA-AFLP技术,系统比较分析了超高产橡胶树和普通株胶乳的转录组,共筛选了两个限制酶对的全部384对引物,最终得到453个经确认的差异表达的基因转录本片段（TDF）,其中247个得到功能注释,这些TDF参与细胞代谢、转录与翻译、防御与胁迫应答、蛋白降解和细胞信号传导等,而只有2个直接参与橡胶生物合成。对差异表达基因的初步分析表明,超高产橡胶树乳管活跃的细胞代谢和良好的胁迫应答机制可能是其高产的主要原因。3.比较分析了橡胶合成相关基因在不同产量单株和品系中的表达水平橡胶延伸因子（REF）、小橡胶粒子蛋白（SRPP）和顺式异戊烯基转移酶（CPT）等10个基因直接参与橡胶生物合成,但它们大多数在胶乳中的表达水平与橡胶树单株（超高产单株及普通对照株）和品系（热研8-79、热研7-33-97和PR107）的产胶水平并不正相关,进一步说明橡胶树超高产的主要原因可能不在橡胶生物合成环节。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 第一章 前言
• 1.1 天然橡胶生产现状
• 1.2 巴西橡胶树的分子生物学研究进展
• 1.2.1 橡胶的生物合成途径
• 1.2.2 橡胶合成相关基因的克隆与功能分析
• 1.2.3 乳管的分子生物学研究
• 1.3 激素对橡胶生物合成调控的研究
• 1.4 cDNA-AFLP技术的基本原理和实验流程
• 1.5 cDNA-AFLP的技术特点
• 1.5.1 需要选择合适的内切酶组合
• 1.5.2 重复性好,假阳性低,可检测低丰度表达的mRNA
• 1.5.3 准确反映基因间表达量的差别
• 1.5.4 全面获取转录组的表达信息
• 1.6 cDNA-AFLP技术应用前景
• 1.6.1 构建转录连锁图
• 1.6.2 cDNA-AFLP基因表达信息与EST序列间的连接、转化
• 1.6.3 分离特异表达基因
• 1.6.4 基因表达特性研究
• 1.7 本研究的目的和意义
• 1.8 技术和路线
• 第二章 橡胶树胶乳转录组分析的银染cDNA-AFLP技术实验体系的建立
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 植物材料
• 2.2.2 酶和化学试剂
• 2.2.3 菌株与质粒
• 2.2.4 合适内切酶组合的选取
• 2.2.5 RNA的提取
• 2.2.6 mRNA的分离
• 2.2.7 cDNA的合成
• 2.2.8 酶切和连接
• 2.2.9 预扩增与选择性扩增
• 2.2.10 电泳
• 2.2.11 银染
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 合适限制性内切酶组合的选取
• 2.3.2 总RNA的提取
• 2.3.3 双链CDNA的合成
• 2.3.4 连接产物的预扩增
• 2.3.5 选择性扩增
• 2.3.6 银染图片背景的优化
• 2.3.7 实验体系的应用实例
• 2.4 讨论
• 第三章 超高产橡胶树与普通橡胶树胶乳差异表达基因的大规模筛选
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 植物材料
• 3.2.2 酶和化学试剂
• 3.2.3 菌株与质粒
• 3.2.4 RNA的提取及质量检测
• 3.2.5 cDNA-AFLP分析
• 3.2.6 差异片段的回收、克隆和测序
• 3.2.7 序列处理及功能注释
• 3.2.8 差异条带的进一步鉴定
• 3.2.9 橡胶合成相关基因的表达分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 RNA的提取
• 3.3.2 双链cDNA的合成
• 3.3.3 连接产物的预扩增
• 3.3.4 选择性扩增及差异片段的筛选
• 3.3.5 序列处理及功能注释
• 3.3.6 差异片段表达模式的RT-PCR验证
• 3.3.7 基因的功能分析
• 3.3.8 橡胶合成相关基因的表达分析
• 3.4 讨论
• 第四章 结论与展望
• 4.1 结论
• 4.2 展望
• 参考文献
• 缩略词表
• 致谢
• 硕士期间发表的文章