针刺治疗实验性抑郁症时成年大鼠海马神经发生的变化

论文摘要

抑郁症是常见的危害人类身心健康的一类精神疾病。随着生活压力的增大和工作节奏的加快,抑郁症的发病率逐年上升。据世界卫生组织统计显示,抑郁症目前已成为世界第四大疾患,到2020年,抑郁症可能成为仅次于心脏病的严重威胁人类健康、增加社会经济负担的第二大疾病。加强抑郁症的防治,寻找积极、有效的治疗方法,具有非常重要的社会和经济意义。目前针对抑郁症的临床治疗手段主要是药物治疗。西药在治疗抑郁症的过程中存在许多问题:疗效不全（有效率仅70%左右）,毒副反应大,起效慢,复发率高等。针刺治疗抑郁症在中国具有悠久的历史,并且具有安全、有效、简便、几乎无毒副作用的优点。但是,由于抑郁症的发病机制错综复杂,至今尚须深入研究。而针刺作为古老的传统医学方法,其作用机理也需要不断探索。因此,继续开展抑郁症及针刺抗抑郁的实验研究具有重要的理论和现实意义。成年哺乳动物脑内神经干细胞的发现彻底打破了中枢神经系统神经元缺乏再生能力的传统观点,也成为神经生物学和神经系统疾病研究的新的热点。海马齿状回（dentate gyrus,DG）终生保持了生成新神经元的能力,即海马神经发生（hippocampal neurogenesis）。因此,海马的整体、细胞及分子各个水平的可塑性变化是抑郁症的神经生物学机制研究的前沿内容之一;而且近年来的研究表明,成年海马神经发生的变化及调控可能会对抑郁症发病和抗抑郁治疗有着显著影响,海马神经发生研究已成为抑郁症病理生理进程研究的一个重要方面。此外有报道表明,针刺治疗脑缺血动物时能通过影响海马脑区的神经发生而起到脑保护的作用。因此,分析成年大鼠神经发生在抑郁症及针刺抗抑郁中的变化,将是针刺抗抑郁机理研究的一个重要内容,也是本论文所要探讨的重要问题。虽然神经发生的过程主要是新生神经元的增殖和分化,但研究表明中枢神经系统的胶质细胞分泌的神经营养因子对神经发生有着重要的调控作用;还有研究提示了胶质细胞尤其是星型胶质细胞在抑郁症发病中也起到了重要的作用。以往的报道还显示,针刺对胶质细胞具有一定的调节作用,那么在抑郁及针刺抗抑郁中星型胶质细胞的变化如何呢?这是本论文需要探讨的另一个问题。脑内的一些神经营养因子如脑源性神经营养因子（brain derivedneurotrophiC factor,BDNF）,胶质细胞源性神经营养因子（glial cellline-derived neurotrophic factor,GDNF）等在抑郁症发病中的作用日趋受到重视。神经元和神经胶质细胞尤其是星型胶质细胞是合成和分泌这两种营养因子的重要来源。BDNF是神经营养因子家族中的重要成员,通过激活其高亲和性受体TrkB而增加突触可塑性,对新生神经元的产生和存活及神经元可塑性起着重要的调节作用。GDNF在外周和中枢神经系统中广泛分布,对多种神经元具有营养、保护和促损伤后修复的作用。GFRα-1是GDNF特异性、高亲和力受体。我室以往的研究及其他实验室的研究分别提示了针刺对GDNF和BDNF及其受体系统有显著的调节作用,那么BDNF、GDNF及其受体系统是否与针刺抗抑郁的作用有关呢?这是本论文要探讨的又一个重要问题。新近几年的研究结果还显示,BDNF、GDNF可能还参与了调节很多抗抑郁药引发的成年后脑内神经发生;而且海马部位给予外源性BDNF也能促进大鼠海马的神经发生。因此,利用细胞培养技术来探讨BDNF、GDNF对海马神经干细胞增殖和分化的影响,将有助于理解这些营养因子与海马神经发生之间的关系。综上所述,本研究拟在慢性不可预知性应激诱导的大鼠抑郁模型上,（1）采用敞箱实验等国际通用的行为学指标,观察电针或经典三环类抗抑郁药氯丙咪嗪对抑郁模型大鼠的治疗作用;（2）采用BrdU掺入法,应用免疫组化等形态学方法,检测抑郁状态及电针抗抑郁治疗后新生神经元的增殖、分化和存活;（3）应用免疫组化等形态学及分子生物学技术,检测抑郁状态及电针抗抑郁治疗后星型胶质细胞标记蛋白GFAP在海马的表达变化:（4）应用免疫组化等形态学及分子生物学技术,检测抑郁状态及电针抗抑郁治疗后内源性BDNF、GDNF及其受体在海马脑区的表达变化;（5）体外培养新生大鼠海马神经干细胞,分别给予BDNF和GDNF,观察其对神经干细胞增殖和分化的影响。实验结果如下:1.电针及三环类抗抑郁药氯丙咪嗪对抑郁模型大鼠的治疗作用大鼠随机分成6组:正常组（Normal）,模型组（Model）,抑郁模型+假电针组（sham EA）,抑郁模型十电针组（EA）,抑郁模型+生理盐水组（Saline）,抑郁模型+氯丙咪嗪组（Clo,5mg/kg）。正常组大鼠不做任何处理;其余组大鼠均接受5周的慢性不可预知性应激刺激,连续刺激2周后,在继续给予应激刺激的同时,对后四组大鼠分别给予假电针、电针、生理盐水和氯丙咪嗪处理（电针和假电针为隔日进行、生理盐水和氯丙咪嗪为每日腹腔注射）,持续3周。每周开始时进行强迫游泳实验检测和一般状况评分;实验开始前、造模两周后及实验结束后进行敞箱实验检测。1.1电针对抑郁模型大鼠的治疗作用敞箱实验、强迫游泳实验及一般状况评分的结果表明,给予大鼠2周的慢性不可预知性应激刺激后,受到应激刺激的各组大鼠（模型组、假电针及电针组）与正常组大鼠相比,其水平运动次数和垂直运动次数显著减少,静止不动时间延长,一般状况评分减少;实验结束（大鼠接受5周应激,同时给予假电针、电针治疗3周）时,模型组和假电针组大鼠的水平运动次数和垂直运动次数显著减少,静止不动时间显著延长,一般状况评分显著减少;而电针治疗组大鼠与假电针组大鼠相比,其水平运动次数和垂直运动次数均显著增加,静止不动时间显著缩短,一般状况评分显著增多。1.2氯丙咪嗪对抑郁模型大鼠的治疗作用敞箱实验、强迫游泳实验及一般状况评分的结果表明,给予大鼠2周的慢性不可预知性应激刺激后,受到应激刺激的各组大鼠（模型组、生理盐水组及氯丙咪嗪组）与正常组大鼠相比,其水平运动次数和垂直运动次数减少,静止不动时间延长,一般状况评分减少;实验结束（大鼠接受5周应激,同时给予生理盐水、氯丙咪嗪治疗3周）时,模型组和生理盐水组大鼠的水平运动次数和垂直运动次数显著减少,静止不动时间显著延长,一般状况评分显著减少;而氯丙咪嗪治疗组大鼠与生理盐水组大鼠相比,其水平运动次数和垂直运动次数均显著增加,静止不动时间显著缩短,一般状况评分显著增多。1.3电针和氯丙咪嗪抗抑郁疗效的比较敞箱实验、强迫游泳实验及一般状况评分的结果表明,给予大鼠2周的慢性不可预知性应激刺激后,受到应激刺激的各组大鼠（模型组、电针组及氯丙咪嗪组）与正常组大鼠相比,其水平运动次数和垂直运动次数减少,静止不动时间延长,一般状况评分减少;实验结束（大鼠接受5周应激,同时分别给予电针、氯丙咪嗪治疗3周）时,模型组大鼠的水平运动次数和垂直运动次数显著减少,静止不动时间显著延长,一般状况评分显著减少:而电针组、氯丙咪嗪组大鼠与模型组大鼠相比,其水平运动次数和垂直运动次数均显著增加,静止不动时间显著缩短,一般状况评分显著增多。电针组大鼠的各行为学测试结果与氯丙咪嗪组大鼠相比,两者无显著性差异。小结:以上行为学的实验结果表明,电针及氯丙咪嗪对慢性不可预知性应激诱导的抑郁模型大鼠的抑郁样行为都有明显的改善作用,提示两者都具有良好的抗抑郁作用;电针的抗抑郁效果与氯丙咪嗪的抗抑郁效果相近。2.电针或氯丙咪嗪治疗对抑郁模型大鼠海马神经发生的影响动物的分组同第一部分。用来检测新生细胞增殖的各组大鼠在实验结束后,腹腔注射BrdU 200mg/kg,24h后进行灌注取材（n=4/组）;用来检测新生细胞存活和分化的各组大鼠在电针或氯丙咪嗪治疗的前两天连续BrdU 100mg/kg/d,实验结束后进行灌注取材（n=4/组）。2.1电针对抑郁模型大鼠海马神经发生的影响免疫组化结果显示正常组大鼠的海马齿状回部位可见到BrdU阳性细胞,表明在生理条件下大鼠海马部位存在神经发生现象。新生细胞增殖检测中BrdU阳性细胞计数的统计结果显示,模型组和假电针组BrdU阳性细胞数明显少于正常组,而电针组BrdU阳性细胞数较假电针组明显增多,与正常组BrdU阳性细胞数相比无统计学差异。新生细胞存活检测所显示的BrdU阳性细胞数的统计结果和上述统计结果相似:模型组和假电针组BrdU阳性细胞数明显少于正常组;而电针组大鼠海马齿状回BrdU阳性细胞数与假电针组相比明显增多,与正常组BrdU阳性细胞数相比较无统计学差异。荧光免疫双标的结果显示:神经元限制性前体细胞的标志物多聚唾液酸神经细胞粘附分子（polysialic acid-neural cell adhesion molecule,PSA-NCAM）阳性细胞与BrdU阳性细胞共存的比例及成熟神经元标志物βⅢ型微管蛋白（classⅢβ-tubul in,TUJ-1）阳性细胞与BrdU阳性细胞共存的比例在各组间无显著性差异。2.2氯丙咪嗪对抑郁模型大鼠海马神经发生的影响新生细胞增殖检测中BrdU阳性细胞计数的统计结果显示:模型组和生理盐水组BrdU阳性细胞数明显少于正常组,而氯丙咪嗪组BrdU阳性细胞数较生理盐水组明显增多,与正常组相比无统计学差异。新生细胞存活检测所显示的BrdU阳性细胞数的统计结果和上述统计结果相似:模型组和生理盐水组BrdU阳性细胞数明显少于正常组;氯丙咪嗪组BrdU阳性细胞数与生理盐水组相比明显增多,与正常组BrdU阳性细胞数相比较无统计学差异。荧光免疫双标的结果显示:PSA-NCAM阳性细胞与BrdU阳性细胞共存的比例及TUJ-1阳性细胞与BrdU阳性细胞共存的比例在各组间无显著性差异。小结上述实验结果表明,生理条件下大鼠的海马齿状回存在神经发生现象;慢性应激造成大鼠海马齿状回部位的神经发生明显减少;在应激继续存在的情况下给予电针或氯丙咪嗪治疗3周后,大鼠海马神经发生显著增多,并恢复到正常动物的神经发生水平;但是无论是电针还是氯丙咪嗪治疗,对这些增殖细胞分化为新生神经元的比例没有影响。结合第一部分行为学实验,结果提示电针或氯丙咪嗪逆转了由应激引起的神经发生的减少,可能是其抗抑郁效果作用机制中的一个环节。3.海马脑区GFAP在大鼠抑郁模型及电针抗抑郁治疗后的表达变化实验分三组,每组12只大鼠（n=12）:正常组（Normal）,模型组（Model）,抑郁模型+电针组（EA）。采用免疫组化、Western Blot技术检测GFAP蛋白的表达变化;采用RT-PCR技术检测GFAP mRNA含量的变化。免疫组化结果显示:正常大鼠海马齿状回和CA3区有较为明显的GFAP表达的阳性细胞（++）,模型组大鼠GFAP阳性细胞染色与正常组相比明显变浅、数目变少（+）,电针组大鼠GFAP阳性细胞染色与模型组大鼠相比显著加深、数目也增多（++）,而与正常组相比无显著性差异。Western Blot结果表明,模型组大鼠海马GFAP蛋白含量与正常组相比显著减少;电针组与模型组相比GFAP蛋白含量显著增高,而与正常组相比GFAP蛋白含量无显著性差异。RT-PCR结果显示,模型组大鼠海马的GFAP mRNA含量与正常组相比显著减少;电针组与模型组相比GFAP mRNA含量显著增高,而与正常组相比GFAP mRNA含量无显著性差异。小结上述实验结果表明,在抑郁模型大鼠中,海马GFAP的蛋白及mRNA含量显著减少,给予电针治疗后,可以逆转海马GFAP的蛋白及mRNA含量的下降,提示星型胶质细胞可能与抑郁症的发病及电针抗抑郁有关。4.海马脑区BDNF、GDNF及其受体TrkB、GFRα-1在大鼠抑郁模型及电针抗抑郁治疗后的表达变化实验分组同3.采用免疫组化、Western Blot技术检测BDNF、GDNF及其受体TrkB、GFRα-1蛋白的表达变化;采用RT-PCR技术检测BDNF、GDNF及其受体TrkB、GFRα-1 mRNA含量的变化。4.1海马BDNF及其受体TrkB在大鼠抑郁模型及电针抗抑郁治疗后的表达变化4.1.1海马BDNF在大鼠抑郁模型及电针抗抑郁治疗后的表达变化免疫组化结果显示:正常大鼠海马齿状回和CA3区有较为明显的BDNF阳性细胞（++）,模型组大鼠BDNF阳性细胞染色与正常组相比明显变浅、数目变少（+）,电针组大鼠BDNF阳性细胞染色与模型组大鼠相比显著加深、数目也增多（++）,而与正常组相比无显著性差异。Western Blot结果表明,模型组大鼠海马BDNF蛋白含量与正常组相比显著减少;电针组与模型组大鼠相比BDNF蛋白含量显著增高,而与正常组大鼠相比BDNF蛋白含量无显著性差异。RT-PCR结果显示,模型组大鼠海马BDNF mRNA含量与正常组相比显著减少;电针组与模型组大鼠相比BDNF mRNA含量显著增高,而与正常组相比BDNF mRNA含量无显著性差异。4.1.2海马TrkB受体在大鼠抑郁模型及电针抗抑郁治疗后的表达变化免疫组化结果显示:正常大鼠海马齿状回和CA3区有较为明显的TrkB阳性细胞（++）,模型组大鼠TrkB阳性细胞染色与正常组相比明显变浅、数目变少（+）,电针组大鼠TrkB阳性细胞染色与模型组大鼠相比显著加深、数目也增多（++）,而与正常组相比无显著性差异。Western Blot结果表明,模型组大鼠海马TrkB蛋白含量与正常组相比显著减少;电针组与模型组大鼠相比TrkB蛋白含量显著增高,而与正常组相比TrkB蛋白含量无显著性差异。RT-PCR结果显示,模型组大鼠海马TrkB mRNA含量与正常组相比显著减少;电针组与模型组大鼠相比TrkB mRNA含量显著增高,而与正常组相比TrkB mRNA含量无显著性差异。4.2海马脑区GDNF及其受体GFRα-1在大鼠抑郁模型及电针抗抑郁治疗后的表达变化4.2.1海马GDNF在大鼠抑郁模型及电针抗抑郁治疗后的表达变化免疫组化结果显示:正常大鼠海马齿状回和CA3区有较为明显的GDNF阳性细胞（++）,模型组大鼠GDNF阳性细胞染色与正常组相比明显变浅、数目变少（+）,电针组大鼠GDNF阳性细胞染色与模型组大鼠相比显著加深、数目也增多（++）,而与正常组相比无显著性差异。Western Blot结果表明,模型组大鼠海马GDNF蛋白含量与正常组相比显著减少;电针组与模型组大鼠相比GDNF蛋白含量显著增高,而与正常组相比GDNF蛋白含量无显著性差异。RT-PCR结果显示,模型组大鼠海马GDNF mRNA含量与正常组相比显著减少;电针组与模型组大鼠相比GDNF mRNA含量显著增高,而与正常组相比GDNF mRNA含量无显著性差异。4.2.2海马GFRα-1在大鼠抑郁模型及电针抗抑郁治疗后的表达变化免疫组化结果表示:正常大鼠海马齿状回和CA3区有较为明显的GFRα-1阳性细胞（++）,模型组大鼠GFRα-1阳性细胞染色与正常组相比明显变浅、数目变少（+）,电针组大鼠GFRα-1阳性细胞染色与模型组大鼠相比显著加深、数目也增多（++）,而与正常组相比无显著性差异。Western Blot结果表明,模型组大鼠海马GFRα-1蛋白含量与正常组相比显著减少;电针组与模型组大鼠相比GFRα-1蛋白含量显著增高,而与正常组相比GFRα-1蛋白含量无显著性差异。RT-PCR结果显示,模型组大鼠海马GFRα-1mRNA含量与正常组相比显著减少;电针组与模型组大鼠相比GFRα-1 mRNA含量显著增高,而与正常组相比GFRα-1 mRNA含量无显著性差异。小结上述实验结果表明,在抑郁状态下大鼠海马部位BDNF、GDNF及其受体TrkB、GFRα-1的蛋白及mRNA含量均显著减少;给予电针治疗后,可以显著提高内源性BDNF、GDNF及其受体TrkB、GFRα-1的含量。结合第一部分行为学实验结果,提示BDNF、GDNF及其受体TrkB、GFRα-1系统可能参与抑郁症的发病及电针抗抑郁作用。5.BDNF、GDNF对体外培养新生大鼠海马神经干细胞增殖和分化的影响5.1新生大鼠海马神经干细胞的培养、神经球的Nestin鉴定及分化鉴定5.1.1新生大鼠海马神经干细胞的培养新生SD大鼠（出生24小时内）海马细胞悬浮培养3-5天后,有部分细胞聚集成团,形成原代神经球。细胞培养7-10天时,显微镜下观察可见大量的神经球存在。细胞生长至7天左右时,进行神经干细胞的传代培养。将原代神经球吹打成单个细胞的悬液再进行培养。传代后神经球形态规则,表面细胞折光性好,活性强。5.1.2神经球的Nestin鉴定Nestin的细胞免疫化学荧光染色结果显示,神经球呈Nestin抗原强阳性。荧光显微镜下见神经球内部呈网状,其中的细胞大多数呈Nestin阳性,神经球周围也可见到Nestin染色阳性的细胞。5.1.3神经干细胞的分化鉴定分别用胶质细胞的标记物GFAP和神经元的标记物TUJ-1进行免疫染色。结果可见神经球在贴壁后48小时已经开始分化,向周边爬出很多神经突起,并分别显示出GFAP免疫阳性及TUJ-1免疫阳性。5.2 BDNF、GDNF对神经干细胞增殖活力的影响实验取第三代神经球做增殖活性检测,分三组:正常神经干细胞培养液（Normal group）;正常培养液中加入BDNF（20 ng/ml,BDNF group）;正常培养液中加入GDNF（20 ng/ml,GDNF group）。分别用CCK-8试剂盒分析在加入培液1天、4天和7天后神经干细胞的增殖活性。结果显示,在第1天和第7天BDNF组和GDNF组吸光度的与正常对照相比有增高趋势但是无统计学意义;而在培养的第4天,BDNF组与正常对照相比吸光度增高,但是无统计学的意义,而GDNF组与正常组相比吸光度明显增高,统计学上具有显著差异。5.3 BDNF、GDNF对神经干细胞分化能力的影响实验取第三代神经球做分化能力的检测,分三组:正常神经干细胞分化液培养（Normal group）:正常分化液中加入BDNF（20 ng/ml,BDNF group）;正常分化液中加入GDNF（20 ng/ml,GDNF group）。三组的神经球在贴壁48小时后已经开始分化,从神经球的周围伸出细胞突起,GFAP免疫荧光染色阳性。BDNF或GDNF处理组的神经球向周围伸出细胞突起的程度与正常组相比更明显。小结在上述实验中我们在体外成功培养出了新生SD大鼠的海马神经干细胞,并进行了神经球的免疫荧光鉴定;分化鉴定的结果提示神经干细胞有向神经元和神经胶质细胞分化的潜能;BDNF及GDNF对神经干细胞增殖和分化影响的检测结果显示,GDNF对神经干细胞的增殖具有促进作用,BDNF和GDNF对干细胞的分化有潜在的促进作用,提示这两种神经营养因子可能参与调节海马部位的神经发生。综上所述,本论文获得以下结论:1.电针或三环类抗抑郁药氯丙咪嗪对抑郁模型大鼠有较好的治疗作用,且电针的抗抑郁效果与氯丙咪嗪的抗抑郁效果相似。2.电针或氯丙咪嗪均可逆转由应激造成的海马神经发生的减少,这有可能是其抗抑郁效果的作用机制中的一个环节。3.抑郁症及电针抗抑郁时,海马GFAP蛋白及mRNA的含量发生变化,提示星型胶质细胞可能与抑郁症发病及电针抗抑郁有关。4.抑郁症及电针抗抑郁时,海马BDNF、GDNF及其受体TrkB、GFRα-1的蛋白及mRNA的含量发生变化,提示这两种神经营养因子可能参与了抑郁症的发病及电针的抗抑郁作用。5.GDNF对体外培养的新生大鼠海马神经干细胞的增殖有显著的促进作用,BDNF、GDNF对其分化有潜在的促进作用,提示这两种神经营养因子可能参与调节海马部位的神经发生。

论文目录

• 英文缩写词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料与方法
• 1 材料
• 2 方法
• 结果
• 1.电针及三环类抗抑郁药氯丙咪嗪对抑郁模型大鼠的治疗作用
• 2.电针或氯丙咪嗪治疗对抑郁模型大鼠海马神经发生的影响
• 3.海马脑区GFAP在大鼠抑郁模型及电针抗抑郁治疗后的表达变化
• 4.海马脑区BDNF、GDNF及其受体TrkB、GFRα-1在大鼠抑郁模型及电针抗抑郁治疗后的表达变化
• 5.BDNF、GDNF对体外培养新生大鼠海马神经干细胞增殖和分化的影响
• 讨论
• 1.慢性不可预知性应激诱导的大鼠抑郁模型的制备及电针或氯丙咪嗪的抗抑郁治疗作用
• 2.成年大鼠海马神经发生在抑郁症及抗抑郁治疗中的作用研究
• 3.神经营养因子BNDF、GDNF在抑郁症及针刺抗抑郁治疗中的作用
• 结论
• 参考文献
• 附录:论文写作与发表
• 致谢
• 综述