水稻淀粉磷酸化酶基因的表达及对稻米品质影响的研究

论文摘要

稻米淀粉主要由直链淀粉和支链淀粉构成,稻米淀粉的组成与结构和稻米蒸煮食用品质、加工品质、甚至产量都有着密切的关联,同时也是决定其工业用途的最主要因素之一。稻米胚乳中淀粉的合成受一系列酶的控制,其中淀粉磷酸化酶是参与淀粉代谢的重要酶类之一,具有L型（质体型）和H型（胞质型）两种同工型。目前对该酶及其编码基因的具体功能,在马铃薯和玉米等植株中已得到很好的证实,但是在稻米品质形成中的作用还不清楚。本研究重点研究了水稻两个淀粉磷酸化酶基因OsPho-L和OsPho-H在水稻中的表达特性及其在不同水稻种质间的等位性变异,并通过转基因技术将OsPho-L基因的RNAi结构导入水稻品种日本晴中,以期分析对OsPho-L基因的表达进行调控后对稻米淀粉品质的影响。主要研究结果如下:1、根据已公布的水稻基因组序列等信息,分析得知OsPho-L和OsPho-H基因都含有15个外显子和14个内含子,分别编码951aa和841aa。两个推导多肽的氨基酸序列具有很明显的淀粉磷酸酶保守结构域,OsPho-L与小麦和拟南芥L型淀粉磷酸化酶同源性分别为83%和73.28%,OsPho-H与小麦和拟南芥H型淀粉磷酸化酶同源性为分别92%和79.19%。2、Southern杂交表明两个淀粉磷酸化酶基因在水稻基因组中是单拷贝的。采用RFLP与微卫星标记检测等技术,分析了两个基因的等位性变异情况,表明两个基因在籼粳稻间存着明显分化,尤其是在栽培稻与野生稻间的分化更为明显。3、通过Northern杂交和Real-Time RT-PCR技术研究了两个淀粉磷酸化酶基因在不同水稻品种及其不同组织器官内在mRNA水平上的表达特性,证明OsPho-L基因只在开花后发育的种子中表达,在根、叶和萌发的种子中几乎没有表达;在发育种子中,该基因在灌浆前中期表达量较高。而OsPho-H基因只在开花后发育的种子中有微量表达,在根、叶和萌发的种子中几乎不表达。不同水稻品种中OsPho-L基因的表达量有所不同,所有水稻品种中OsPho-L基因的表达量要高于OsPho-H基因。4、从一个优质水稻品种苏御糯基因组BAC文库中筛选获得了两个含OsPho-L基因全长序列的BAC阳性克隆,并从中克隆了该基因起始密码子上游2.0kb的启动子区序列,构建了含不同长度启动子序列与GUS编码区的融合基因,并都导入了水稻品种武香粳9号中。GUS活性分析表明,由长度为2.0kb或1.5kb的启动子控制的GUS基因在转基因水稻种子胚乳、叶和茎等组织中都有很强的表达,而在胚和萌发种子中的表达量很低,花药和颖壳中基本没有表达;2.0kb启动子指导的GUS基因在茎中表达最强,而1.5kb启动子指导的GUS基因则在胚乳中表达最强。0.5kb长的OsPho-L基因启动子已有足够能力使外源基因在转基因水稻中表达,但其表达特性没有严格的组织特异性。5、在双元载体上构建了OsPho-L基因的RNAi结构,并通过农杆菌介导的转化法导入了水稻品种日本晴中。分子检测证明目的基因已整合入转基因水稻基因组中。在转基因水稻中抑制OsPho-L基因的表达后,对成熟籽粒形状和外观以及理化品质性状等都没有产生明显的影响,但是可明显降低淀粉RVA谱中的峰值粘度、热浆粘度和冷胶粘度。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• １前言
• 1.1 植物淀粉合成及其主要酶类
• 1.2 淀粉的磷酸化及其功能
• 1.3 淀粉磷酸化的酶学机制
• 1.4 禾谷类作物中的淀粉磷酸化酶
• 1.5 本研究的目的
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 质粒与细菌菌株
• 2.1.3 PCR 引物
• 2.1.4 化学试剂
• 2.2 序列获取及基因结构分析
• 2.3 水稻总DNA 和总RNA 的提取
• 2.3.1 微量总DNA 的提取
• 2.3.2 大量总DNA 的提取
• 2.3.3 总RNA 的提取
• 2.4 编码区部分序列的克隆
• 2.4.1 PCR 扩增
• 2.4.2 PCR 产物的克隆与序列测定
• 2.5 OsPho-L 基因启动子的克隆
• 2.5.1 含OsPho-L 基因BAC 克隆的筛选
• 2.5.2 OsPho-L 基因启动子序列的PCR 扩增
• 2.5.3 PCR 产物的克隆与测序分析
• 2.6 微卫星分子标记设计与检测
• 2.6.1 微卫星分子标记的设计
• 2.6.2 微卫星分子标记的检测
• 2.7 地高辛标记DNA 探针的制备
• 2.8 Southern 杂交分析
• 2.9 Northern 杂交分析
• 2.10 Real-Time RT-PCR 分析
• 2.10.1 参照基因与引物
• 2.10.2 第一链cDNA 的合成
• 2.10.3 Real-Time PCR 分析
• 2.11 OsPho-L 基因启动子系列缺失与GUS 融合表达载体的构建
• 2.12 OsPho-L 基因RNA 干扰载体的构建
• 2.13 根癌农杆菌介导培育转基因水稻
• 2.13.1 水稻的组织培养
• 2.13.2 根癌农杆菌的培养及其介导的水稻转化
• 2.13.3 抗性愈伤组织的筛选及植株再生
• 2.14 转基因水稻植株中GUS 活性的分析
• 2.14.1 GUS 组织化学染色分析
• 2.14.2 GUS 活性的定量测定
• 2.15 水稻成熟种子理化品质性状的测定
• 2.15.1 样品前处理
• 2.15.2 直链淀粉含量的测定
• 2.15.3 胶稠度的测定
• 2.16 水稻成熟种子淀粉粘滞性谱（RVA）的测定
• 3 结果与分析
• 3.1 水稻淀粉磷酸化酶基因的结构与编码序列
• 3.1.1 OsPho-L 和OsPho-H 基因的结构
• 3.1.2 OsPho-L 和OsPho-H 氨基酸序列分析
• 3.1.3 OsPho-L 和OsPho-H 基因部分序列的PCR 克隆与序列分析
• 3.2 不同水稻品种间淀粉磷酸化酶基因的等位性变异分析
• 3.2.1 RFLP 分析
• 3.2.2 OsPho-L 基因5’上游调控区一个微卫星多态性的分析
• 3.3 水稻淀粉磷酸化酶基因的表达特性
• 3.3.1 OsPho-L 基因的表达特性
• 3.3.2 OsPho-H 基因的表达特性
• 3.3.3 不同水稻品种胚乳中OsPho-L 和OsPho-H 基因表达的差异
• 3.3.4 缺失分支酶基因表达水稻品种中OsPho-L 基因的表达
• 3.4 OsPho-L 基因启动子控制的GUS 融合基因的表达特性
• 3.4.1 不同长度OsPho-L 基因启动子与GUS 融合表达载体的构建
• 3.4.2 转GUS 融合基因水稻植株的获得
• 3.4.3 转基因水稻植株的分子鉴定
• 3.4.4 不同GUS 嵌合基因在转基因水稻植株中的表达
• 3.4.5 种子萌发过程中GUS 融合基因的表达特性
• 3.5 RNA 干扰OsPho-L 基因表达对稻米品质的影响
• 3.5.1 RNA 干扰载体的构建与鉴定
• 3.5.2 转基因水稻植株的获得
• 3.5.3 转基因水稻植株的分子鉴定
• 3.5.4 转基因水稻植株中OsPho-L 基因的表达
• 3.5.5 RNA 干扰转基因水稻成熟种子中淀粉的品质表现
• 4、小结与讨论
• 4.1 研究小结
• 4.2 水稻淀粉磷酸化酶基因的结构特点
• 4.3 水稻淀粉磷酸化酶基因的表达特点
• 4.4 水稻淀粉磷酸化酶基因的功能
• 4.5 研究展望
• 参考文献
• 致谢