牛白细胞介素2基因克隆、表达及多克隆抗体的制备

论文摘要

牛白细胞介素2主要是由辅助性T淋巴细胞产生的一种淋巴因子,通过免疫网络调控机体免疫功能,在机体免疫反应中起着极为重要的作用。因其具有免疫增强剂、抗肿瘤和抗感染的特点是理想的免疫佐剂和免疫治疗剂。但正常情况下,机体产生的BoIL-2的量非常有限,一定程度上限制了对BoIL-2的研究和应用。本实验主要应用重组DNA和基因表达技术,通过RT-PCR方法克隆BoIL-2基因,并对其基因序列进行分析和表达,旨在为大量制备和生产高效价廉的BoIL-2,为其生物学活性及应用研究奠定基础。根据Genbank发表的BoIL-2基因序列,设计了一对引物。以ConA刺激的外周血淋巴细胞（PMN）为材料,提取总RNA,应用RT-PCR的方法,扩增BoIL-2基因序列。琼脂糖凝胶电泳显示目的片段约为477bp。测序结果显示,克隆的BoIL-2基因与Genbank发表的BoIL-2基因序列同源性为98.7%,氨基酸同源性为99.4%。将测序正确的pMD-18-T-IL-2重组质粒及pET30a（+）载体,用EcoRI及SalI进行双酶切,分别回收后T4连接酶进行连接,转化、提取重组质粒。通过双酶切及PCR鉴定阳性的重组质粒进行序列测定后在大肠杆菌的表达,分子量约为23.49ku;表达产物主要分布在包涵体中。Western Blot证实所得到的重组蛋白为BoIL-2重组蛋白。通过MTT法测定BoIL-2重组蛋白的活性,可知重组BoIL-2（rBoIL-2）对牛及山羊淋巴细胞有明显作用,对猪淋巴细胞作用不明显。用镍离子亲和树脂对所得的BoIL-2重组蛋白进行纯化,并免疫新西兰兔成功制备兔抗rBoIL-2多克隆抗体,为下阶段的研究提供了重要的实验材料。

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摘要

Abstract

1 引言

1.1 细胞因子概述

1.1.1 细胞因子研究概况

1.1.2 细胞因子的产生

1.1.3 细胞因子的共同特性

1.1.4 细胞因子在兽医学中的应用

1.2 BOIL-2 的研究进展

1.2.1 IL-2 及IL-2R 的结构特点

1.2.2 IL-2 的生物学功能

1.2.3 IL-2 的应用

1.3 研究目的与意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验动物

2.1.2 菌种与载体

2.1.3 工具酶和主要试剂

2.1.4 其它相关试剂

2.1.5 标准参照物

2.1.6 主要试剂的配制

2.1.7 仪器设备

2.2 实验方法

2.2.1 从牛外周血淋巴细胞中分离总RNA

2.2.2 BoIL-2 基因RT-PCR 扩增

2.2.3 PCR 扩增片段的克隆

2.2.4 重组质粒的鉴定

2.2.5 原核表达载体的构建

2.2.6 重组质粒的鉴定

2.2.7 重组BoIL-2 在大肠杆菌表达系统中的诱导表达

2.2.8 免疫印记（Western-blot）分析

2.2.9 重组蛋白的纯化

2.2.10 纯化蛋白的复性

2.2.11 MTT 法测重组蛋白的生物活性

2.2.12 多克隆抗体的制备

2.2.13 多克隆抗体的鉴定

2.3 数据处理

3 结果

3.1 牛外周血淋巴细胞中分离总RNA

3.2 RT-PCR 法扩增编码 BoIL-2 基因序列

3.3 PCR 产物的纯化与回收

3.4 重组质粒 pMD-18-T-IL-2 的鉴定

3.4.1 重组质粒pMD-18-T-IL-2 菌落PCR 鉴定

3.4.2 重组质粒pMD-18-T-IL-2 的限制性内切酶鉴定

3.4.3 重组质粒pMD-18-T-IL-2 的PCR 鉴定

3.4.4 重组质粒pMD-18-T-IL-2 的测序结果及分析

3.5 BoIL-2 基因在大肠杆菌中的表达及多克隆抗体的制备

3.5.1 重组表达质粒的鉴定

3.5.2 重组蛋白的表达、鉴定与纯化

3.5.3 MTT 法测定BoIL-2 重组蛋白的生物活性

3.5.4 多克隆抗体的制备

4 讨论

4.1 BOIL-2 基因的克隆与序列分析

4.2 BOIL-2 在大肠杆菌中的表达与纯化

4.3 复性重组蛋白生物学活性的测定

4.4 多克隆抗体的制备及鉴定

5 结论

致谢

参考文献

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