蛋白激酶抑制剂的筛选与活性化合物的分子药理学研究

论文摘要

可逆性的磷酸化是细胞分裂受到精密调控的一个基本分子机制。已经证实蛋白激酶家族,如周期依赖性激酶（CDKs）、保罗样激酶（PLKs）和极光激酶（AURKs）对细胞周期的调控起着重要作用。在哺乳动物中,保罗样激酶家族由四个高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶组成,它们有不同的亚细胞定位和功能,其中PLK1在细胞增殖调节中发挥着最重要的作用,研究的最为深入。人类的极光激酶家族包括三个成员Aurora A、B和C,在有丝分裂中和其他蛋白协同发挥作用。这两个激酶家族都和癌症产生密切相关,被视为抗癌药物的潜在有力的靶点。为了更有效地筛选具有抗肿瘤作用的激酶抑制剂,本研究利用分子生物学方法,从Hela细胞中提取总RNA,再通过RT-PCR及PCR手段,得到Aurora A和PLK1编码基因（AURKA、PLK1）的克隆;以人类睾丸组织的cDNA为模板得到Aurora C编码基因（AURKC）的克隆,连接到pMD-18T载体,构建了克隆质粒。再将此片断连接至表达载体pET-30a-c（+）中,构建重组表达载体,并转化宿主菌E.Coli BL21。IPTG诱导表达后通过Ni2+柱亲合层析对表达产物进行纯化,获得了比较高纯度的重组Aurora A、Aurora C和PLK1激酶。为构建三种激酶抑制剂的生化筛选模型奠定了基础。本研究还以酵母保罗样激酶CDC5蛋白的温度敏感型突变株为模式菌,应用96孔微板培养澄清度观察法（微板培养法）累积筛选了3000份发酵液和3192个化合物,筛选得到1个β-咔啉碱类阳性化合物DH166。在10μg/ml浓度下与野生型菌株相比cdc5-2突变型菌株对DH166表现出更高的敏感性,生长受到抑制,野生型酵母却能正常生长;应用酶联免疫标记法检测DH166的体外PLK1抑制活性,结果显示DH166能够以竞争型抑制的方式抑制PLK1的活性;应用MTT法检测DH166对于HepG2、A549细胞的毒性,发现DH166能够抑制这两种细胞的增殖;通过流式细胞仪检测DNA含量研究DH166对于酵母和肿瘤细胞周期的影响,结果发现DH166可以将酵母和A549细胞阻滞在G2/M期;利用Annexin V-FITC/PI、Hochest 33342染色法发现DH166能诱导A549细胞的凋亡;应用流式细胞仪研究DH166对A549细胞中CyclinB1降解的影响,发现DH166能抑制Cyclin B1蛋白的降解;利用计算机辅助Dockingmodel显示DH166进入PLK1的激酶活性中心并占据ATP所在位置;利用酵母模型和MTT法对13个DH166同系物的生物活性进行了初步研究。实验结果首次证明了DH166对于PLK1的抑制活性是其抗肿瘤活性的重要原因之一。酿酒酵母属于简单的单细胞真核生物,易于培养,且生长迅速,作为重要的模式生物在本研究中被用来初筛PLK1的抑制剂。利用这一筛选系统,我们首次发现了微生物产物β-咔啉碱类化合物对PLK1抑制活性,从而为靶向PLK1的药物筛选与活性评价以及β-咔啉碱类衍生物作用机制的深入研究奠定了基础。

论文目录

• 目录
• 英文缩略语
• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 PLK1、AURORAA和AURORAC的表达及纯化
• 1.实验材料
• 1.1 菌种
• 1.2 细胞株
• 1.3 质粒
• 1.4 培养基
• 1.4.1 E coli培养基
• 1.4.2 Hela培养基
• 1.5 工具酶
• 1.6 抗生素
• 1.7 常用试剂盒
• 1.8 常用试剂
• 1.8.1 琼脂糖凝胶电泳试剂
• 1.8.2 SDS-PAGE试剂
• 1.8.3 细胞消化传代使用液
• 1.8.4 Western Blot试剂
• 1.8.5 蛋白纯化相关溶液
• 1.8.6 激酶活性检测相关溶液
• 1.8.7 其他试剂
• 1.9 主要实验仪器
• 2.实验方法
• 2.1 人Hela细胞复苏
• 2.2 人Hela细胞传代培养
• 2.3 人Hela细胞冻存
• 2.4 人Hela细胞总RNA的提取（Trizol）
• 2.4.1 用Trizol试剂（Invitrogen）进行细胞总RNA的提取
• 2.4.2 总RNA的琼脂糖凝胶电泳
• 2.4.3 RNA浓度测定
• 2.5 RT-PCR（Invitrogen）
• 2.6 引物设计
• 2.7 最适PCR温度的摸索
• 2.8 PCR产物琼脂糖凝胶电泳,切胶回收
• 2.8.1 琼脂糖凝胶电泳
• 2.8.2 PCR产物的纯化回收（PCR产物纯化试剂盒）
• 2.8.3 DNA浓度及纯度检测
• 2.9 PCR产物末端加A反应
• 2.10 重组克隆质粒的构建及验证
• 2.10.1 PCR产物与克隆载体pMD-18T（Takara）载体连接
• 2.10.2 E.coli DH5α/BL21感受态细胞的制备
• 2.10.3 重组克隆质粒转化E.coliDH5α感受态细胞
• 2.10.4 重组克隆质粒的验证
• 2.11 重组表达质粒的构建及验证
• 2.11.1 表达载体和重组克隆质粒分别双酶切
• 2.11.2 回收凝胶中的DNA片段（DNA纯化回收试剂盒）
• 2.11.3 基因片断和表达载体的连接
• 2.11.4 基因片断和表达载体连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞
• 2.11.5 基因与表达载体连接产物检测
• 2.12 蛋白的诱导表达
• 2.12.1 重组表达质粒转化E.coli BL21（DE3溶原菌）
• 2.12.2 宿主菌的保存
• 2.12.3 接种冻存培养菌
• 2.12.4 诱导培养物的光密度分析
• 2.12.5 含有重组表达质粒的E.coli BL21的生长
• 2.12.6 含有重组表达质粒的E.coli BL21的诱导
• 2.12.7 含有重组表达质粒的E.coli BL2的诱导优化
• 2.13 SDS-PAGE
• 2.13.1 对照组样品处理
• 2.13.2 IPTG诱导组样品处理
• 2.13.3 制胶、上样和电泳
• 2.14 Western-blot分析
• 2.15 纯化蛋白
• 2.15.1 柱的预处理（column preparation）
• 2.15.2 样品的预处理（sample preparation）
• 2.15.3 使用（A|¨）KTA prime系统纯化蛋白
• 2.15.4 收集含有目的蛋白的洗脱液,蒸馏水进行透析,然后冷冻干燥保存
• 2.16 纯化蛋白定量
• 2.17 纯化蛋白酶活测定
• 2.18 抑制剂筛选体系的建立
• 2.18.1 系统优化
• 3.结果和分析
• 3.1 重组表达质粒构建流程图
• 3.2 人Hela细胞总RNA的提取及浓度测定
• 3.3 Aurora A、Aurora C和PLK1基因片段的克隆
• 3.4 重组克隆质粒的构建及验证
• 3.4.1 PCR验证
• 3.4.2 双酶切验证
• 3.4.3 测序验证
• 3.5 表达质粒的构建和验证
• 3.5.1 PCR验证
• 3.5.2 双酶切验证
• 3.5.3 测序验证
• 3.6 SDS-PAGE分析蛋白诱导表达结果
• 3.6.1 全蛋白SDS-PAGE
• 3.6.2 诱导蛋白的可溶性分析
• 3.7 Western-blot结果
• 3.8 表达蛋白的纯度分析
• 3.9 纯化蛋白的浓度测定
• 4.讨论
• 5.结论
• 第二部分 PLK1激酶抑制剂的筛选和活性验证
• 1.实验材料
• 1.1 菌株
• 1.2 细胞株
• 1.3 培养基
• 1.4 试剂盒
• 1.5 抗体
• 1.6 试剂
• 1.6.1 激酶活性分析试剂
• 1.6.2 细胞消化传代使用液
• 1.6.3 细胞周期及凋亡检测试剂
• 1.6.4 细胞增殖抑制实验试剂
• 1.6.5 检测Cyclin B1蛋白含量试剂
• 1.7 其他主要材料
• 1.8 主要仪器设备
• 1.9 分子对接
• 2.实验方法
• 2.1 PLK1抑制剂的筛选
• 2.1.1 酵母CDC5和人类PLK1保守区域序列比对
• 2.1.2 筛选模型
• 2.1.3 化合物的稀释
• 2.1.4 筛选方法
• 2.1.5 筛选结果判断
• 2.2 MIC的确定
• 2.3 初筛阳性化合物对PLK1抑制作用的生化分析方法
• 2.3.1 利用生化分析方法测定阳性化合物对PLK1作用
• 2.3.2 阳性化合物对PLK1激酶活性抑制方式的探讨
• 2.4 MTT法检测阳性化合物及其衍生物对肿瘤细胞增殖的抑制作用
• 2.4.1 阳性化合物及其衍生物对A549细胞增殖的抑制作用
• 2.4.2 阳性化合物对BEL-7402和HepG2细胞的增殖抑制作用
• 2.5 流式细胞仪检测阳性化合物对肿瘤细胞周期的影响
• 2.6 染色法检测细胞凋亡
• 2.6.1 Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡
• 2.6.2 Hochest 33342染色检测细胞凋亡
• 2.7 流式细胞仪检测Cyclin B1蛋白含量
• 2.8 阳性化合物与PLK1活性位点对接
• 2.8.1 蛋白结构调出
• 2.8.2 蛋白3D模型优化
• 2.8.3 确定活性位点
• 2.8.4 阳性化合物与PLK1活性位点对接
• 3.实验结果
• 3.1 酵母CDC5与人类PLK1激酶保守区域序列比对
• 3.2 酵母模型筛选结果
• 3.3 阳性化合物DH166 MIC的测定
• 3.4 阳性化合物DH166抑制纯化的重组PLK1激酶
• 3.4.1 阳性化合物DH166抑制体外纯化的PLK1的激酶活性
• 3.4.2 阳性化合物DH166竞争性抑制纯化的PLK1激酶的活性
• 3.5 阳性化合物DH166抑制肿瘤细胞的增殖
• 3.6 阳性化合物DH166影响肿瘤细胞的细胞周期
• 3.7 阳性化合物DH166能诱导酵母细胞的周期阻滞
• 3.8 阳性化合物DH166能诱导A549细胞凋亡
• 3.8.1 Annexin V-FITC/PI双染法检测
• 3.8.2 Hochest 33342染色法检测
• 3.9 DH166导致A549细胞内Cyclin B1的积累
• 3.10 阳性化合物DH166与PLK1的分子对接
• 3.10.1 PLK1 3D结构的获取和活性位点分析
• 3.10.2 阳性化合物DH166与PLK1活性位点对接结果
• 3.11 阳性化合物DH166同系物对A549及酵母细胞的增殖具抑制作用
• 4.讨论
• 4.1 模式生物-酵母
• 4.2 蛋白激酶在抗癌药物研究中的应用
• 4.3 β-咔啉碱类化合物的抗肿瘤研究
• 4.4 多元药理学
• 5.结论
• 参考文献
• 综述一 保罗样激酶1（PLK1）研究进展
• 1.染色体上的定位
• 2.蛋白结构特点
• 2.1 催化结构域
• 2.2 PBD结构域
• 3.蛋白表达量的变化及调节
• 3.1 转录水平上的调控
• 3.2 翻译后修饰
• 3.3 泛素-蛋白酶体通路降解
• 3.4 蛋白之间的相互作用
• 4.功能总述
• 4.1 G2/M期转化
• 4.2 DNA损伤检验点及检验点造成的阻滞后细胞周期的再启动
• 4.3 参与中心体成熟以及纺锤丝形成过程
• 4.4 高尔基体的解体
• 4.5 姐妹染色单体的分离
• 4.6 胞质分裂和有丝分裂的退出
• 5.与癌症的关系
• 6.以PLK1为靶点的治疗方法
• 6.1 基因操作
• 6.1.1 反义寡核苷酸（ASO）
• 6.1.2 小RNA干扰（siRNA）
• 6.1.3 抗体注射技术
• 6.1.4 显性抑制技术
• 6.2 小分子抑制剂
• 6.2.1 ATP竞争型抑制剂
• 6.2.2 非ATP竞争型抑制剂
• 7.结语
• 参考文献
• 综述二 极光激酶A、C研究进展
• 1.家族成员
• 2.基因概述
• 3.蛋白结构
• 4.定位
• 5.激酶活性的调节
• 5.1 Aurora A转录水平的调节
• 5.2 激活
• 5.2.1 Ajuba介导的Aurora A活化
• 5.2.2 TPX2介导的Aurora A活化
• 5.2.3 I-2介导的Aurora A活化
• 5.3 抑制
• 5.4 降解
• 5.4.1 APC/C-CDH1介导的降解
• 5.4.2 AIP介导的降解
• 6.功能
• 6.1 Aurora A的功能（图4）
• 6.1.1 G2/M期转换
• 6.1.2 中心体成熟和分离
• 6.1.3 双极纺锤体的组装
• 6.1.4 胞质分裂
• 6.1.5 抑癌基因p53
• 6.1.6 端粒酶活性
• 6.2 Aurora C的功能
• 7.与癌症的关系
• 8.以AURORAA为靶点的抗肿瘤药物
• 8.1 Azaindoles
• 8.2 MLN8054
• 8.3 咪唑并吡啶类
• 8.4 五元杂环并吡唑类
• 8.5 单嘧啶环类
• 8.6 嘧啶氨基喹啉类
• 8.7 喹唑啉类
• 8.8 苯氨基喹唑啉类
• 8.9 嘧啶和吡啶氨基喹唑啉类
• 8.10 五元杂环氨基喹唑啉类
• 9.结语
• 参考文献
• 致谢