棉花防卫反应相关基因类似物的克隆与特征分析和受黄萎病诱导表达的两个全长cDNA的获得

论文摘要

植物在自然界中受到许多病原物的威胁，如病毒、细菌、真菌、线虫等。棉花是重要的经济作物，棉纤维是主要的纺织原料。而棉花的病害比较多，我国枯萎病、黄萎病尤其严重，给棉花生产造成很大的损失。实践证明，种植抗病品种是防治病害的最经济有效的方法。陆地棉是我国棉花的主栽品种，陆地棉抗枯萎病育种非常成功，但黄萎病抗病品种的培育一直是育种家的一大难题，主要原因在陆地棉中找不到免疫或高抗的黄萎病抗源。根据其他作物中克隆的抗病基因与防卫反应基因的信息，分离鉴定棉花抗病基因类似物（resistance gene analogs，RGAs）与防卫基因类似物（defense gene analogs，DGAs），有助于直接克隆或开发与棉花抗病基因紧密连锁的标记，定位、克隆抗病基因，为培育抗病品种奠定基础。 本研究选用我国遗传研究和育种广泛利用的抗黄萎病品种海岛棉海7124（G．barbadense L．cv．Hai7124）为材料来克隆抗病基因类似物（RGAs）和防卫基因类似物（DGAs）。成功分离了79条核糖体结合位点（Nucleotide binding site，NBS）类RGAs，21条丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶（Serine／Threonine kinase，STK）类RGAs和11条DGAs。棉花中已经报道的NBS类RGAs有143条，我们分离的79条NBS类RGAs中13条与已克隆的棉花RGAs没有序列相关性，其它66条序列与已克隆的棉花RGAs有85％～99％的序列同源性。将本研究分离的79条NBS类RGAs与先前克隆的143条RGAs进行聚类分析，所有这些NBS类RGAs可以分为十个亚类（Ⅰ～Ⅹ），其中亚类Ⅸ的所有成员由本研究克隆的5条序列组成。与其它双子叶作物中得到的结果类似，我们分离的具有连续开放读框的NBS类RGAs依其氨基酸序列可以分为两类，具有Toll-白介素-1受体（Toll-Interleukin-1 receptor，TIR）与不具有该结构的non-TIR。这两类RGAs都存在NBS类RGAs保守的六个基元：P-loop、RNBS-A、Kin-2、RNBS-B、RNBS-C、GLPL。鉴定了棉花TIR与non-TIR各自所特有的RNBS-A序列。为棉花R基因和NBS类RGAs的分

论文目录

• 原创性声明
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• 摘要
• ABSTRACT
• 本文所用主要缩略词
• 第一部分 文献综述
• 第一章 植物抗病相关基因研究进展
• 1 植物的抗病机制
• 2 植物抗病反应的分子假说与作用模式
• 3 植物抗病基因的克隆策略
• 3.1 转座子标签法
• 3.2 图位克隆法
• 3.3 基于保守序列的候选基因法
• 4 植物抗病基因的结构与分类
• 4.1 NBS-LRR类
• 4.2 LRR-TM类
• 4.3 LRR-TM-STK类
• 4.4 STK类
• 4.5 TM类
• 4.6 其他类型
• 5 防卫反应基因及其应用
• 5.1 与植保素合成有关的基因
• 5.2 病程相关蛋白基因
• 5.2.1 β-1，3-葡聚糖酶基因及其应用
• 5.2.2 几丁质酶基因及其应用
• 第二章 棉花黄萎病及其抗病育种的研究进展
• 1 棉花黄萎病的发现
• 2 棉花黄萎病菌在我国的危害
• 3 黄萎病的致病机理
• 4 棉花对黄萎病的抗病机制
• 4.1 棉花与黄萎病菌的识别与互作机制
• 4.2 棉花对黄萎病的形态抗性
• 4.3 棉花对黄萎病的生理生化抗性
• 4.3.1 抗毒素与抗病性的关系
• 4.3.2 酶与抗病性的关系
• 4.3.3 糖类物质与抗病性的关系
• 4.3.4 内源激素与抗病性的关系
• 5 棉花抗黄萎病分子育种
• 5.1 棉花黄萎病的分子标记辅助育种
• 5.2 棉花抗黄萎病的转基因研究
• 本研究的目的与意义
• 第二部分 研究报告
• 第三章 海岛棉抗病基因类似物与防卫基因类似物的分离及特征分析
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 DNA的提取
• 1.3 引物与PCR扩增
• 1.4 扩增产物的电泳，回收，克隆及测序
• 1.5 序列分析与进化树的构建
• 1.6 Southern杂交分析
• 1.6.1 试剂及其配制
• 1.6.2 Southern印迹
• 1.6.3 DIG标记探针
• 1.6.4 杂交
• 1.6.5 洗膜与显色
• 1.7 RNA的提取所用材料与方法
• 1.7.1 材料与病菌处理
• 1.7.2 接种方法
• 1.7.3 取材
• 1.7.4 RNA的提取
• 1.8 RT-PCR
• 1.8.1 DNA的消化
• 1.8.2 cDNA第一链的合成:
• 1.8.3 RT-PCR
• 1.9 RGAP与DGAP的PCR扩增与 PAGE/银染
• 1.10 定位分析
• 2 结果与分析
• 2.1 棉花RGAs与DGAs的克隆鉴定
• 2.2 棉花RGAs与DGAs的序列分析
• 2.2.1 棉花NBS类RGAs的序列分析
• 2.2.2 棉花STK类RGAs的序列分析
• 2.2.3 棉花DGAs的序列分析
• 2.3 棉花NBS类RGAs的基因组杂交
• 2.4 棉花RGAs与DGAS的表达分析
• 2.5 部分RGAs与DNAs的染色体定位
• 3 讨论
• 3.1 利用简并引物需要注意的问题
• 3.2 棉花NBS类RGAs的多样性
• 3.3 NBS类基因在棉花基因组中的拷贝数
• 3.4 PCR法分离STK类RGAs
• 3.5 PCR法分离DGAs
• 3.6 RGAs与DGAs的染色体定位
• 3.7 棉花RGAs和DGAs与黄萎病抗性的关系
• 第四章 一个棉花β-1，3-葡聚糖酶基因全长cDNA的克隆与特征分析
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 RNA的提取
• 1.3 cDNA片段来源及5’RACE与3’RACE
• 1.4 Southern杂交
• 1.5 Northern杂交
• 1.5.1 RNA甲醛琼脂糖凝胶变性电泳
• 1.5.2 Northern转膜
• 1.5.3 探针的制备与杂交
• 2 结果与分析
• 2.1 棉花β-1，3-葡聚糖酶基因全长序列的获得
• 2.2 β-1，3-葡聚糖酶基因的结构分析
• 2.3 棉花GbGLU与其它作物及棉花中已克隆的β葡聚糖酶的比较分析
• 2.4 GbGLU的基因组杂交
• 2.5 GbGLU的表达分析
• 3 讨论
• 3.1 棉花GbGLU的结构特征及其在基因组中的拷贝数
• 3.2 β-1，3-葡聚糖酶与抗病相关保守功能域的预测
• 3.3 棉花GbGLU与黄萎病抗性的关系
• 3.4 GbGLU对棉花黄萎病抗性育种的意义
• 第五章 一个棉花受体类似蛋白激酶基因cDNA全长的克隆与特征分析
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 RNA的提取
• 1.3 5’RACE与3’RACE
• 1.4 Southern杂交
• 1.5 Northern杂交
• 2 结果与分析
• 2.1 棉花受体类似蛋白激酶cDNA全长的克隆
• 2.2 棉花GbRLK的结构分析
• 2.3 GbRLK与棉花中已克隆的该类基因及其它作物激酶类基因的比较分析
• 2.4 GbRLK在棉花基因组中拷贝数分析
• 2.5 GbRLK的表达分析
• 3 讨论
• 3.1 侯选基因法克隆棉花抗病基因的可行性
• 3.2 棉花GbRLK的结构与特征
• 3.3 棉花GbRLK的可能作用机理
• 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 发表论文及申请专利情况