甜椒小分子量热激蛋白基因的克隆及其在温度逆境下的功能分析

论文题目: 甜椒小分子量热激蛋白基因的克隆及其在温度逆境下的功能分析

论文类型: 博士论文

论文专业: 植物学

作者: 郭尚敬

导师: 孟庆伟

关键词: 甜椒,温度胁迫,小分子量热激蛋白,转基因烟草,光抑制,大肠杆菌,原核表达

文献来源: 山东农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 遇到高温胁迫时植物体内会产生应急蛋白——热激蛋白,其中植物小分子量热激蛋白含量最为丰富、种类繁多。小分子量热激蛋白的分子量在17～30 kDa 之间,有保守的C端。高等植物中含有至少6种小分子量热激蛋白,分别定位于细胞质、叶绿体、线粒体、内质网。在常温下植物体内小分子量热激蛋白基因不表达,高温时小分子量热激蛋白则快速积累。近年来,关于高温诱导热激蛋白以及热激蛋白提高植物耐热性的研究取得了重要进展。然而,关于低温诱导热激蛋白基因表达及其在低温光破坏防御中作用的研究相对较少。本研究从甜椒叶片中分离到小分子量热激蛋白基因CaHSP26 和CaHSP18。表达模式和功能分析表明,这两个基因的表达受高温逆境诱导,在高温胁迫下对植物、大肠杆菌的蛋白有保护作用;低温条件下过量表达对烟草、大肠杆菌均有保护作用。主要结果如下: 1. 利用同源序列设计兼并引物,通过RT-PCR 的方法从甜椒叶片克隆到叶绿体小分子量热激蛋白基因的中间片段,通过5’-RACE 和3’-RACE 分别克隆到5’片段和3’片段,拼接后设计特异引物扩增到全长917 bp cDNA,ORF 为708 bp,编码235 个氨基酸的多肽,分子量约为26 kDa。同源序列比较发现,甜椒叶绿体小分子量热激

论文目录:

摘要

Abstract

英文缩写符号及其中英文对照

1 前言

1.1 HSP 的研究进展

1.1.1 HSP 的结构特点

1.1.2 热激反应的时间

1.1.3 HSP 的功能

1.1.3.1 HSP 具有分子伴侣作用

1.1.3.2 HSP 与植物的耐热性

1.1.3.3 HSP 与植物的抗冷性

1.1.3.4 HSP 与植物的抗氧化能力

1.1.3.5 HSP 在植物发育中的作用

1.1.4 HSP 基因启动子结构特征

1.1.5 HSP 基因的表达调控

1.2 叶绿体小分子量 HSP

1.2.1 叶绿体sHSP 是sHSP 基因超家族的成员

1.2.2 叶绿体sHSP 的结构

1.2.3 叶绿体sHSP 与植物的耐热性

1.2.4 叶绿体sHSP 与植物的耐冷性

1.2.5 叶绿体sHSP 的分子伴侣功能

1.3 本研究目的、意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 菌株与质粒

2.1.3 酶及生化试剂

2.1.4 PCR 引物

2.2 实验方法

2.2.1 利用 TRIZOL 试剂盒提取RNA

2.2.2 反转录cDNA 第一条链的合成

2.2.3 目的基因全长cDNA 的分离

2.2.3.1 中间片段的获得

2.2.3.2 目的基因cDNA 3′端片段的分离(3′-RACE)

2.2.3.3 目的基因cDNA 5′端片段的分离(5′-RACE)

2.2.3.4 目的基因全长cDNA 的克隆

2.2.4 Northern 杂交分析

2.2.4.1 总 RNA 的提取

2.2.4.2 甲醛变性胶电泳

2.2.4.3 转膜

2.2.4.4 预杂交

2.2.4.5 探针的制备

2.2.4.6 杂交

2.2.4.7 洗膜

2.2.4.8 放射自显影

2.2.5 Southern 杂交

2.2.5.1 基因组 DNA 的提取

2.2.5.2 基因组 DNA 的限制性内切酶消化

2.2.5.3 转膜

2.2.5.4 探针合成

2.2.5.5 预杂交、杂交及放射自显影

2.2.6 RT-PCR 结合 Southern 杂交

2.2.7 叶绿体 CaHSP26 基因正义表达载体的构建

2.2.7.1 编码区cDNA 添加酶切位点

2.2.7.2 质粒 DNA 的提取

2.2.7.3 酶切反应

2.2.7.4 去磷酸化

2.2.5.5 回收

2.2.7.6 连接

2.2.7.7 转化

2.2.7.8 重组子的筛选

2.2.8 农杆菌介导转化烟草

2.2.8.1 农杆菌感受态细胞的制备

2.2.8.2 冻融法转化农杆菌

2.2.8.3 利用农杆菌介导转化烟草

2.2.9 转基因烟草植株的 PCR 检测

2.2.9.1 CTAB 法微量法提取基因组 DNA

2.2.9.2 转基因植株的 PCR 筛选

2.2.10 转基因烟草生理指标的测定

2.2.10.1 光合放氧量的测定

2.2.10.2 叶绿素荧光参数测定

2.2.10.3 P700 在 820 nm 光吸收

2.2.10.4 扫描电镜样品的制作与观察

2.2.11 小分子量热激蛋白的原核表达

2.2.11.1 原核表达载体的构建

2.2.11.2 E.coli BL21 原核表达的诱导

2.2.11.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

2.2.11.4 大肠杆菌细胞活力实验

3 结果与分析

3.1 CaHSP26 的分离及其特征

3.1.1 CaHSP26 中间片段的分离

3.1.2 CaHSP26 基因全长的克隆

3.1.3 CaHSP26 基因序列分析

3.1.3.1 CaHSP26 表达产物二级结构预测

3.1.3.2 基因序列同源性分析

3.2 CaHSP26 在甜椒基因组中由单基因编码

3.3 基因表达特性分析

3.3.1 热激诱导 CaHSP26 的表达

3.3.2 CaHSP26 在甜椒不同器官中的表达量不同

3.3.3 CaHSP26 在甜椒器官中的表达受热激时间的影响

3.3.4 CaHSP26 基因在甜椒热激后恢复过程中的表达

3.3.5 低温对 CaHSP26 表达的影响

3.4 异源表达 CaHSP26 基因提高大肠杆菌在高温和低温下的活力

3.4.1 原核表达载体pET-CaHSP26 的构建

3.4.2 转基因大肠杆菌的检测

3.4.3 CaHSP26 的转入对大肠杆菌在适温(37℃)条件下的生长没有影响

3.4.4 CaHSP26 基因表达提高大肠杆菌的耐热性

3.4.5 低温条件下该基因的表达对大肠杆菌的保护作用

3.5 CaHSP26 基因的表达减轻了烟草的光抑制

3.5.1 正义表达载体 PBI-CaHSP26 的构建

3.5.2 克隆载体的 PCR 检测

3.5.3 表达载体的 PCR 检测

3.5.4 甜椒 CaHSP26 基因转化烟草及转基因植株的分子检测

3.5.5 甜椒 CaHSP26 基因在烟草中的表达

3.5.6 高温和低温条件下转 CaHSP26 基因对烟草放氧活性的影响

3.5.7 烟草中过量表达 CaHSP26 减轻 PSⅡ和 PSⅠ的光抑制

3.5.8 过量表达 CaHSP26 对烟草叶片形态结构的影响

3.6 甜椒细胞质小分子量热激蛋白基因(CaHSP18)的克隆及序列分析

3.6.1 甜椒CaHSP18 基因的克隆

3.6.2 CaHSP18 表达产物二级结构预测

3.6.3 CaHSP18 同源性检索及其同源性分析

3.6.4 氨基酸序列的系统进化分析

3.6.5 甜椒 CaHSP18 属于一个多基因家族

3.6.6 CaHSP18 基因在甜椒幼苗中的表达

3.6.7 异源表达 CaHSP18 基因提高大肠杆菌中在高温和低温下的生存能力

4 讨论

4.1 CaHSP26 和 CaHSP18 基因序列特征

4.2 CaHSP26 和CaHSP18 与耐热性

4.3 CaHSP26 和CaHSP18 与耐冷性

4.4 热激蛋白与植物的光破坏防御机制

4.5 下一步工作设想

5 结论

参考文献

附录1

致谢

攻读学位期间已发表和待发表的论文

发布时间: 2005-10-11

参考文献

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[4].莲金属硫蛋白和热激蛋白基因在种子活力中的功能分析[D]. 周玉亮.中山大学2011
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[6].酿酒酵母耐热分子调控系统的构建与应用[D]. 刘月芹.天津大学2014
[7].热激信号转导中钙原初反应的分子机理初探[D]. 高飞.河北师范大学2008

甜椒小分子量热激蛋白基因的克隆及其在温度逆境下的功能分析

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