抑癌蛋白Vitamin D3 up-regulated protein 1在肺癌中的表达及其意义

论文摘要

研究背景：肺癌作为一种恶性肿瘤,其发病率和死亡率居各种恶性肿瘤榜首,近年来甚是呈上升趋势,已成为21世纪全球面临的最严峻的健康问题之一。在中国,据预测到2025年,肺癌患者将达到100万,居世界第1位。而肺癌的发病机制复杂,是多因素、多基因、多阶段共同参与的结果。因此,发现并证实与肺癌相关基因蛋白,可以更深入了解肺癌发生发展机理,提供判断肺癌预后、转移的分子标志物,找到治疗肺癌靶点,从而有效控制肺癌的侵袭、转移,提高病人5年生存率,这是肿瘤研究的重点内容,也是肿瘤防治研究中的一个难点问题。维生素D3上调蛋白（Vitamin D3 up-regulaited protein 1, VDUP1）最早被发现在活性维生素D刺激后的HL-60细胞中表达,是一种维生素D相关分子。VDUP1作为早期反应基因,具有多种生物学功能,参与了氧化应激,应力信号转导,细胞生长与分化,脂质代谢及粘膜免疫等过程,证实与糖尿病、肿瘤、心血管等复杂疾病密切相关。VDUP1是主要氧化还原调控蛋白硫氧还蛋白（thioredoxin, TRX）的关键抑制因子,而TRX和谷胱苷肽（GSH）系统是并行重要的抗氧化调控系统。VDUP1是一种多功能蛋白,主要对细胞的稳定起作用,多种因素可促进其表达。研究证实,VDUP1在不同的肿瘤组织和细胞株中有不同程度的下降。VDUP1主要涉及细胞的增殖、分化及调亡。VDUP1的过表达可以使细胞周期停止从而阻止细胞分化。VDUP1与TRX相互作用,负向调节其表达和TRX氧化功能。VDUP1-/-小鼠出现明显的免疫系统缺陷,包括自然杀伤细胞的形成和功能构建。VDUP1作用主要涉及细胞增值、分化及凋亡。2003年Song等报道VDUP1是一种肿瘤抑制蛋白,参与了多种肿瘤的增殖、侵袭及转移的调控。近年来多项研究证明VDUP1可以促进细胞凋亡,参与抑制增生,调控固有免疫细胞从而影响肿瘤等发生发展。在乳腺癌、肾癌、肝癌等肿瘤中证实VDUP1具有抑制肿瘤演进和转移的作用。Cristina等以未接受化疗的乳腺癌病人为研究对象,分析VDUP1与预后因素,例如组织分化程度、肿瘤大小、年龄及甾体激素受体情况等的相关性,发现VDUP1表达量高的病人预后较好,5年中位生存率较高。Kwon发现VDUP1-/-小鼠更容易形成肝癌,并导致TNF-α以及NF-κp的升高,推测VDUP1可能通过抑制TNF-α和NF-κβ从而负向调节肝癌形成。Jeon等培育VDUP1基因敲除小鼠和野生型小鼠的肺成纤维细胞,通过EMSA、免疫沉淀等方法证实抑癌蛋白VDUP1可能通过抑制JAB增强p27kip1稳定性,而p27kip1的缺失是被认为与大多数恶性肿瘤的发生相关。这提示我们VDUP1与恶性肿瘤的发生、发展呈负相关,可能具有抑制肿瘤的作用。2006年Filby等研究绵羊胎儿肺膨胀对VDUP1表达的影响,发现VDUP1位于支气管和肺泡上皮细胞以及一些间叶细胞,在正常肺发育中其表达与细胞增殖成负相关性。所以,VDUPI可能是膨胀诱导的肺细胞增殖重要调节因子。Eugene [43]等报道通过与癌旁组织相比,VDUP1等转录基因在肺癌组织中的表达量下降。同时发现在人胚胎肺里VDUP1等基因表达量是增高的。故肺发展过程中这些变化的基因可以被高度认为是肺癌诊断分级的情报候选分子标志。故本研究拟采用荧光定量PCR、western-blot检测和观察35例肺癌组织及癌旁组织、western-blot检测1种人肺癌细胞株及1种人正常气道上皮细胞株中VDUP1的表达情况；分析VDUP1在肺癌中的表达及其与各临床病理参数之间的关系,初步探寻早期肺癌的监测指标,为肺癌的诊断、综合治疗方案设计、预后提供一定的理论依据。方法1.VDUP1蛋白在人正常气道上皮细胞和肺癌细胞中的表达研究人正常支气管上皮细胞系16-HBE采用含12%胎牛血清的MEM完全培养基；人腺癌细胞株A549采用10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养。待细胞90%融合后铺满培养皿后方可进行细胞的全蛋白提取。采用Bradford法测定蛋白含量,波长设定为595nm。算出蛋白浓度后,进行分装。将变性蛋白加入槽内,进行电泳、转膜、封闭,孵育1抗、2抗,最后进行曝光显影,扫描分析数据,最终判定A549人肺腺癌细胞株和人正常气道上皮细胞株16HBE中的VDUP1蛋白表达情况。2. VDUP1蛋白在人体正常肺组织和常见肺恶性肿瘤组织的表达研究液氮研钵组织,加入TRIzo1,移入DEPC处理过的离心管,依次加入氯仿、异丙醇及无水乙醇,最后适量无核酸酶的水溶解RNA。取适量RNA溶液用ND-1000微量分光光度计测定其浓度,RT-PCR反应分两步：第一步,逆转录阶段,扩增时取0.5μg的总RNA,反应条件：37℃15min（反转录反应阶段）,85℃5s（反转录酶失活部分）。反应完毕,即可得到cDNA （不用时-70℃保存）。第二步：Real Time PCR扩增反应（使用SYBR GreenⅠ嵌合荧光法）。使用应用Mx3005PTM Real Time PCR扩增仪。Western blot方法同前。最终经统计分析VDUP1在人鳞癌、腺癌、细支气管肺癌、小细胞肺癌及相对应癌旁组织中VDUP1蛋白表达情况。3、VDUP1蛋白在肺癌组织中的表达及临床意义收集南方医科大学南方医院2010年1月至2010年9月手术切除、临床资料完整的肺癌病例35例。标本均经病理确诊,取相对应肿瘤病灶远处（d）10cm正常肺组织作为对照,获取组织后立即放入一80℃冰箱保存。应用SPSS16.0统计软件进行处理,采用方差ONE WAY ANOVA检验分析VDUP1蛋白表达水平与如性别、年龄、有无吸烟史、肺癌细胞分化程度及肺癌TNM临床分期等各临床病理参数之间的关系；对肺癌TNM临床分期进行分层比较,了解VDUP1在肺癌各期的表达差异。结果1、VDUP1蛋白在人正常气道上皮细胞和肺癌细胞中的表达研究Western blot检测结果显示,肺癌细胞A549蛋白、正常人气道上皮细胞16-HBE中的VDUP1/GAPDH灰度比值分别为：0.22±0.28,0.47±0.28（P<0.05）,故VDUP1蛋白在正常人气道上皮细胞株表达高于人腺癌细胞株。2. VDUP1蛋白在人体正常肺组织和常见肺恶性肿瘤组织的表达研究采用荧光定量PCR和Western blot检测人肺癌组织及相对应的癌旁组织中的VDUP1基因及蛋白的表达情况。One Way ANOVA结果显示：人肺癌组织及相对应的癌旁组织中的VDUP1基因相对表达量分别为：0.67±0.56,2.29±1.95；人肺癌组织及相对应的癌旁组织中的VDUP1蛋白相对表达量分别为：1.98±0.48,0.91±0.25 （VDUP1/GAPDH灰度比值）。无论VDUP1基因还是蛋白表达情况,VDUP1在肺癌组织均显著低于癌旁组织中的表达（P<0.05,P<0.05）。3、VDUP1蛋白在肺癌组织中的表达及临床意义将VDUP1蛋白表达和临床病理参数进行单因素分析,VDUP1蛋白表达与肺癌患者的性别、年龄大小、吸烟史、肺癌病理类型等因素无关。共选入病例35例,其中男性23例,女性12例,VDUP1蛋白表达量为：0.93±0.26,0.89±0.22；发病年龄38-80岁,中位年龄57.6岁,以60岁为界,VDUP1蛋白表达量为：0.93±0.26,0.90±0.24；有无吸烟史：有吸烟史的表达量：0.89±0.26,而无吸烟史的为0.96±0.21；鳞状细胞癌13例,腺癌12例,细支气管肺泡癌4例,小细胞肺癌3例,非典型肺癌3例,VDUP1蛋白表达量分别为：0.96±0.24,0.95±0.24,0.68±0.11,0.92±0.28,0.92±0.37（P值分别为：0.640,0.790,0.420,0.343）。与肿瘤的分化程度、临床分期有关（P值均<0.05）。通过多重分析可知,低中高分化肺癌的VDUP1蛋白表达分别为的0.83±0.60,0.91±0.26,1.17±0.07,三者之间具有统计学差异。临床晚期（Ⅲ、Ⅳ期）肺癌表达（0.79±0.24）显著低于早期（Ⅰ、Ⅱ期1.03±0.20）肺癌（P<0.05）。结论1.无论在肿瘤细胞水平还是实体肿瘤组织水平,VDUP1蛋白的表达显著低于正常细胞和组织水平,表明VDUP1的缺失可能导致肿瘤发生发展；2.无论基因水平还是蛋白水平,VDUP1在肿瘤组织中表达均显著低于正常组织,表明VDUP1参与了肿瘤组织的发生发展,可能从多方面调控肿瘤发展进程；3. VDUP1蛋白在非小细胞肺癌组织中低表达而在肺癌相对应正常组织中表达量较高,结合临床病理资料分析,发现VDUP1与病理的分化程度、临床分期关系密切,表明与患者预后密切相关。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 VDUP1蛋白在肺癌细胞株A549中的表达
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第二章 VDUP1蛋白在肺癌组织中的表达及临床意义
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 中英文缩略词对照表
• 攻读硕士期间主要成果
• 致谢
• 统计学证明